中国兰科植物新记录种
——安南金线兰及其金线莲苷含量测定

韩 玉，陈慧玲，王硕硕，梁秀婷，吴锦忠，吴岩斌*，郑承剑

(1. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2. 海军军医大学药学院中药鉴定学教研室，上海 200433)

金线兰属AnoectochilusBlume 属于兰科Orchidodeae 头骨兰族 Cranichideae 斑叶兰亚族Goodyerinae[1]，全世界有40 余种，主要分布于印度和喜马拉雅东部、东亚、东南亚至澳大利亚以及西南太平洋岛屿等地区[2—3]。我国现有金线兰属植物约21 种[3,4]，其中金线兰A.roxburghii分布最广，是福建特色中药金线莲的基原植物，具有保肝、降血糖、抗肿瘤、抗衰老、抗炎、抗类风湿性关节炎等药理作用[5—11]。金线兰属植物的植株形态较相似，民间均当作金线莲使用。近年来，国内陆续有金线兰属新种[3,4,12—14]、新记录种[15—17]的报道，而金线兰属植物形态特征相似，不易分辨，因此同属植物常常混用。作者于云南省发现一种金线兰属植物，经过形态解剖和鉴定，确定为安南金线兰AnoectochilusannamensisLindl.，为国内新记录种。此外，为明确安南金线兰的药用价值，对金线兰属植物所含主要活性成分金线莲苷含量进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器试剂

安南金线兰于2019 年12 月采自云南省西双版纳傣族自治州普洱市景东彝族自治县，凭证标本存放于福建中医药大学中药资源标本馆。SZ61 体视显微镜(日本奥林巴斯)；DFT-200 手提式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；AUY220 电子天平(日本岛津公司)；KQ-500DE 数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；EasySep®-3030 高效液相色谱仪(上海通微分析技术有限公司)；UM5800 Plus蒸发光散射检测器(上海通微分析技术有限公司)。金线莲苷对照品(自制，纯度＞98%)、goodyeroside A 对照品(自制，纯度＞98%)。

1.2 方法

1.2.1 植物形态观察

安南金线兰移栽开花后，对植株的形状、大小、色泽、表面特征及质地等性状进行观察，在体视镜下对花进行解剖并拍照。

1.2.2 HPLC-ELSD 图谱及含量测定

1.2.2.1 色谱条件

参照文献[4]色谱条件进行优化，色谱柱ChromCore AQ-C18 (250 mm × 4.6 mm，3 μm)；流动相：超纯水(100%)，等度洗脱；流速0.5 mL·min-1；柱温25 ℃；蒸发光散射检测器雾化温度70 ℃，载气流速2.5 L·min-1；进样量5 μL。

1.2.2.2 对照品溶液配制

精密称定金线莲苷和goodyeroside A 对照品各4 mg，使用超纯水配制成1.0 mg·mL-1goodyeroside A 溶液和1.0 mg·mL-1金线莲苷溶液，0.45 μm 滤膜过滤，得到对照品溶液。

1.2.2.3 供试品溶液制备

安南金线兰植株60 ℃干燥后粉碎，过60 目筛，精密称定粉末0.1 g，置于50 mL 三角瓶，加超纯水20 mL，密塞，超声提取45 min，用0.45 μm 滤膜过滤，得到供试品溶液。

1.2.2.4 线性关系考察

将上述制备的金线莲苷和goodyeroside A 对照品溶液稀释至 500 μg·mL-1、400 μg·mL-1、250 μg·mL-1、 200 μg·mL-1、 125 μg·mL-1、100 μg·mL-1，按“1.2.2.1”项色谱条件进样测定，以金线莲苷和goodyeroside A 对照品质量浓度的对数值为横坐标(x)，峰面积对数值为纵坐标(y)，分别绘制标准曲线，得出回归方程。

1.2.2.5 精密度试验

精密吸取“1.2.2.2” 项下金线莲苷和goodyeroside A 混合对照品溶液5 μL，连续进样6次，记录金线莲苷和 goodyeroside A 的峰面积，并分别计算其RSD 值。

1.2.2.6 重复性试验

取同一份安南金线兰样品，按“1.2.2.3”项制备6 份供试品溶液，按“1.2.2.1”项色谱条件进样，记录金线莲苷和goodyeroside A 的峰面积，并分别计算其RSD 值。

1.2.2.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液，按“1.2.2.1”项色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h 进行测定，记录金线莲苷和goodyeroside A 的峰面积，并分别计算其RSD 值，考察供试品在24 h 内稳定性。

1.2.2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一安南金线兰样品6份，每份0.05 g，分别精密加入与样品中测定的金线莲苷和goodyeroside A 相当含量的对照品，按“1.2.2.3”项下方法制备6 份，按“1.2.2.1”项色谱条件进样测定，计算金线莲苷和goodyeroside A 的加样回收率和RSD 值。

1.2.2.9 样品含量测定

精密称定安南金线兰样品0.1 g，按“1.2.2.3”项下方法制备供试品溶液3 份，按“1.2.2.1”项色谱条件进样测定，根据回归方程计算样品中金线莲苷和goodyeroside A 含量。

2 结果与分析

2.1 新记录种

安南金线兰(新拟) (图1 A～J)

图1 安南金线兰植物形态特征Fig. 1 Morphology of Anoectochilus annamensis

Anoectochilus annamensisLindl. Averyanov L V in Rheedea 15(2): 83-101. 2005. Fig. 1 a-e.

陆生草本植物，植株高15～25 cm，茎直立，节上生根，具2～5 枚叶。叶片卵圆形，长3～5 cm，宽2.2～3.5 cm，上面深绿色或暗紫色，具有黄白色或红色带有绢丝光泽的网纹，背面淡绿色或紫红色，先端急尖，基部近圆形，骤狭呈柄；叶柄长6～10 mm，叶柄基部扩大成抱茎的鞘。总状花序具2～8 朵花，长7～16 cm；花序轴被短柔毛，具2～3 枚淡粉色鞘状苞片，花苞片淡红色，卵状披针形，先端渐尖，具短柔毛，长4～6 mm，宽2～4 mm；子房圆柱形，扭转，被柔毛，连花梗长6～10 mm，宽1～1.5 mm；花白色，倒置(唇瓣位于下方)；萼片背面被柔毛，中萼片卵圆形，长约4.5 mm，宽约3.5 mm，先端急尖，与花瓣粘合呈兜状；侧萼片张开，呈偏斜的长圆状椭圆形，长7～9 mm，宽3～4 mm；花瓣近镰刀状，与中萼片近等长；唇瓣长17～20 mm，呈Y 字形，前部扩大并2 裂，裂片条状长圆形，长9 mm，宽2 mm，中部收狭，其两侧各具2～5 条长短不等的短流苏；距黄绿色，长约8 mm，与子房近平行，末端2 浅裂，内侧具2 枚盾状胼胝体；蕊柱黄色，长5～5.5 mm；蕊喙直立，叉状2裂；柱头2 个，离生，位于蕊喙基部两侧。花期4～5 月。

根据上述特征，确定其为Anoectochilus annamensisLindl.，中文名命名为安南金线兰。

引证标本：中国云南省西双版纳傣族自治州普洱市景东彝族自治县常绿阔叶林山坡，沈志军2019122601，存放于福建中医药大学中药资源标本馆。

分布：越南[18]。中国首次记录。

2.2 金线莲苷含量测定

2.2.1 线性关系

金线莲苷和goodyeroside A 的回归方程分别为y=1.6721x-2.5841 (相关系数r=0.9981)和y=1.5128x-2.1405 (相关系数r=0.9977)，结果表明金线莲苷和goodyeroside A 在100～500 μg·mL-1质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系。

2.2.2 精密度试验

测得金线莲苷和goodyeroside A 峰面积的RSD值分别为2.05%和2.65%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验

测得金线莲苷和goodyeroside A 峰面积的RSD值分别为1.99%和2.24%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验

测得金线莲苷和goodyeroside A 峰面积的RSD值分别为3.44%和2.56%，表明供试品溶液24 h 内稳定性良好。

2.2.5 加样回收率试验

测得金线莲苷和goodyeroside A 的平均回收率分别为97.38%和101.59%，RSD 值分别为1.38%和1.93%，表明该方法样品的加样回收率良好。

2.2.6 样品含量

安南金线兰的HPLC-ELSD 色谱图见图2。安南金线兰中金线莲苷和goodyeroside A 含量分别是53.34±1.21 mg·g–1和29.32±0.45 mg·g–1，金线莲苷含量高于goodyeroside A 含量。

图2 安南金线兰HPLC-ELSD 色谱图Fig. 2 HPLC-ELSD chromatogram of Anoectochilus annamensis

3 讨论

安南金线兰与丽蕾金线兰植株形态相似[18—19]，不同的是，安南金线兰唇瓣中部两侧各具2～5 条长短不等的短流苏，而丽蕾金线兰唇瓣中部两侧为1～3 短的细齿，两者区别明显。金线莲苷(内酯苷类成分)是金线兰的主要活性成分之一，在金线兰中其含量为10%左右，具有降血糖、抗高脂血症和抗自身免疫性肝炎等多种生物活性，goodyeroside A 是金线莲苷的差向异构体，却不具以上活性。HPLC-ELSD检测结果显示，安南金线兰中金线莲苷含量高于goodyeroside A 含量。课题组前期研究显示，丽蕾金线兰中的内酯苷类成分主要是goodyeroside A，含量远高于金线莲苷[4]。因此，通过金线莲苷和goodyeroside A 的含量差异也可区分安南金线兰和丽蕾金线兰。此外，安南金线兰中金线莲苷含量虽然高于goodyeroside A，但仅为53.34 mg·g–1，低于多数文献报道金线兰的金线莲苷含量[5]。因此，安南金线兰能否替代金线兰作药用，当作金线莲的替代资源，还有待进一步研究。