MCC950 的作用靶点及其在中枢神经系统疾病治疗中作用机制研究进展

洪咏日，姚宝珍

武汉大学人民医院儿科，武汉 430000

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）炎症小体是一种多蛋白复合物，是近几年研究最为广泛的炎症小体，它能被多种病原体如细菌、病毒等，或多种致病事件如线粒体功能障碍、活性氧产生等激活。NLRP3 炎症小体的激活可诱导促炎反应的发生，消除致病物质以维持机体的健康。然而，NLRP3 炎症小体的过度激活可导致多种疾病，目前已经发现许多疾病的发生发展与NLRP3 激活以及下游炎症因子的释放有关，如动脉粥样硬化、痛风和肥胖等［1-3］，同时NLRP3 炎症小体介导的神经炎症是中枢神经系统疾病发生发展的关键因素［4］。随着对疾病中NLRP3炎症小体激活和调节机制的深入研究，靶向抑制NLRP3 炎症小体是疾病治疗的重要策略。MCC950 也称为CP-456，773，是一种含二芳基磺酰脲的化合物。2001年，PERREGAUX 等［5］在脂多糖活化的单核细胞和巨噬细胞中添加一种二芳基磺酰脲化合物后发现IL-1β 含量下降，且IL-6 和肿瘤坏死因子-α 不受影响。因此，他首次将这种化合物命名为CRIDs，并定义为IL-1β的拮抗剂。COLL 等［6］进一步的研究才发现，CRID3通过抑制NLRP3 炎症小体的激活来减少IL-1β 的成熟和释放，并将其重新命名为MCC950。MCC950 是一种特异性的小分子抑制剂，可以透过血脑屏障选择性地阻断NLRP3炎症小体的激活，减少下游IL-1β的成熟和释放。目前已有研究［7］表明，MCC950对中枢神经系统疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病以及代谢性疾病有治疗作用，多项关于MCC950 的临床研究也已经开展。近年来，对MCC950 的研究不断扩大，其作用靶点逐渐被阐明，且在治疗多种中枢神经系统疾病方面显示出良好的疗效，如帕金森病（Parkinson's disease，PD）、阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）、创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）、癫痫等，MCC950 通过抑制NLRP3/IL-1β通路的激活来减轻炎症反应从而治疗疾病。我们综述了MCC950 的作用靶点及其在中枢神经系统疾病治疗中作用机制研究进展，以期为MCC950 的进一步研究和应用提供相关见解，为治疗NLRP3 激活相关疾病提供新思路和治疗靶点。

1 MCC950的作用靶点

NLRP3 炎症小体由传感器分子NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和效应器半胱天冬酶-1前体（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1，procaspase-1）组成。NLRP3 包含一个N 端吡啶结构域（pyrin domain，PYD）、一个核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding and oligomerization domain，NACHT）和一个C 末端富含亮氨酸的重复序列（leucine-rich repeat，LRR）。当NLRP3 激活后，其N 端PYD 识别并结合ASC 的PYD，募集ASC 和pro-Caspase-1，从而形成NLRP3 炎症小体［8］。NLRP3 炎性小体的活化分两步完成：启动和激活两个阶段。启动阶段：当机体受到伤害时，在病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）等作用下，通过IL-1β 和肿瘤坏死因子-α 等细胞因子介导Toll 样受体（Toll like receptors，TLR）或肿瘤坏死因子受体（Tumor necrosis factor receptor，TNFR）激活核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路，导致NLRP3 转录与表达升高［9］。激活阶段：NLRP3和募集的ASC、pro-caspase-1组装成稳定的复合物，切割pro-caspase-1 成为具有活性的caspase-1，该分子继而促进IL-1β 与IL-18 成熟和分泌，且使Gasdermin D 裂解成片段并穿透细胞引发细胞焦亡［10］。由于NLRP3 炎症小体激活过程复杂，MCC950 抑制NLRP3 炎性小体激活的具体作用靶点尚不明确，但目前的普遍共识是MCC950 不作用于NLRP3 炎症体激活的启动阶段，而是作用于NLRP3炎症小体激活组装阶段［6］。

1.1 NIMA 相关蛋白7（NIMA-related kinase 7，NEK7） NEK7 是一种有丝分裂所必需的中心体蛋白。有研究［11］表明，NEK7 是钾外流的感受器，钾外流导致NEK7 与NLRP3 结合，并募集凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing， ASC）以完成炎性体的组装。因此，钾外流、NEK7 和NLRP3 三者之间的相互作用最开始被认为是MCC950 的潜在靶点。后续COLL 等［6］发现，MCC950 抑制巨噬细胞中IL-1β 释放却不影响钾离子流出，表明MCC950 并不影响钾外流过程。XU等［12］通过对肺组织裂解物进行蛋白质免疫共沉淀发现，MCC950 抑制了NLRP3 和NEK7 之间的结合，提示NLRP3 和NEK7 相互作用为MCC950 的潜在作用靶点。NEK7 依赖活性氧的磷酸化，能增强NEK7 和NLRP3 之间的相互作用，从而促进NLRP3 炎症体的激活［11］。使用活性氧的抑制剂N-乙酰半胱氨酸可阻断NEK7 的磷酸化，从而阻碍NEK7 与NLRP3 的相互作用及下游IL-1β 的产生。然而，在PERERA等［13］研究中发现，MCC950 并不影响NEK7 的磷酸化。因此目前MCC950 影响NEK7 和NLRP3 之间相互作用的确切机制尚有待进一步研究。

1.2 ASC ASC 是NLRP3 炎症小体的重要组成部分，位于炎症小体的中心。它属于二分蛋白质，包含一个N 末端的热蛋白样结构域（PYD）和C 末端的含胱天蛋白募集域（caspase activation and raise domain，CARD），PYD和CARD是同源的蛋白—蛋白相互作用结构域，两者介导ASC 的寡聚并以此来放大炎症信号［14］。此外，在NLRP3 炎症小体的组装过程中，ASC 通过PYD 与NLRP3 的PYD 相互作用，ASC的CARD 负责招募效应器pro-caspase-1 并与之结合［15］。一项研究［6］发现，MCC950抑制了尼日利亚菌诱导的ASC的寡聚，用50 μmol/L的MCC950处理经NLRP3 和ASC 转染后的T 细胞，再将其进行免疫共沉淀，结果发现MCC950 并不影响NLRP3 与ASC 之间的相互作用，表明MCC950 抑制NLRP3 诱导的ASC 的寡聚，但不影响NLRP3 与ASC 之间的相互作用。值得注意的是，有研究［16］发现，MCC950 能够阻断骨髓细胞中NLRP3 炎症小体通路。然而，人类外周血单核细胞中NLRP3 炎症小体的形成并不依赖于ASC 的寡聚。因此，MCC950 的作用并不只局限于抑制ASC 的寡聚，后续还需要进一步的研究来确定MCC950作用于ASC的确切分子机制。

1.3 氯离子 VERHOEF 等［17］报道，细胞外氯离子浓度的改变会影响由ATP 刺激所引起的Caspase-1的激活和下游IL-1β 的产生。氯离子细胞内通道（chloride intracellular channels， CLICs）是炎症反应过程中氯离子外流的关键阴离子通道。GREEN等［18］的研究表明，抑制CLICs 可阻断ASC 寡聚和炎性小体组装。TANG 等［19］发现，CLICs 的拮抗剂能够阻碍NEK7-NLRP3-ASC 复合体的相互作用。以上均表明，通过CLICs 的氯离子外流在ASC 寡聚和炎性小体的组装中起着重要的作用。研究［20］发现，MCC950 可以阻止ASC 的寡聚，但不能阻止钾外流、肿瘤坏死因子-α 的分泌、AIM2 或NLRC4 的激活；与之相似地是，抑制氯离子外流影响ASC 的寡聚，但对钾离子外流、肿瘤坏死因子-α 的分泌、NLRP3 和Caspase-1 mRNA 的表达没有影响。因此，MCC950对ASC 寡聚的抑制作用可能与其抑制氯离子外流有关，CLICs 及其上游也可能是MCC950 的靶点，这种可能性及其机制需要进一步探索。

1.4 NACHT中的Walker B 基序 NLRP3的中心结构域—NACHT 介导的自我寡聚在NLRP3 炎症小体的组装中发挥重要作用［8］。在一项光亲和标记实验［21］中发现，MCC950 竞争性地抑制探针与NLRP3的结合，提示MCC950与NLRP3的直接作用。COLL等［6］研究发现，无论NLRP3 处于何种激活状态，MCC950 都会直接和NLRP3 特异性结合，并且这种高亲和力、可逆的非共价相互作用发生在NLRP3 的NACHT中的Walker B位点处，NLRP3激活过程中结构会发生重排，产生更“开放”的构象。在TAPIAABELLÁN 等［22］的研究中发现，MCC950 通过与Walker B 基序相互作用，来阻止ADP-ATP 交换，并将炎症复合体锁定为“封闭的”非活性构象，从而抑制下游炎症体的组装。综上，NLRP3 中NACHT 结构域中的Walker B 基序是MCC950 的重要作用靶点之一。

2 MCC950 在中枢神经系统疾病治疗中的作用机制

神经炎症是中枢神经系统疾病发病机制的重要组成部分，过度的神经炎症会导致神经元死亡、加剧神经系统疾病的发展。NLRP3 炎症小体介导的炎症在神经损伤的病理过程中起着关键的作用，MCC950通过抑制不同通路中NLRP3的激活以阻断神经炎症的发生，从而成为治疗疾病的新靶标，至今已在多种神经系统疾病模型中看到MCC950 的疗效。

2.1 MCC950在PD治疗中的作用机制 PD是一种神经退行性病变，以黑质中多巴胺能神经元的严重丧失为特征，且伴有慢性神经炎症、线粒体功能障碍以及α-突触核蛋白聚集体的病理性累积。研究［23］表明，α-突触核蛋白聚集体介导NLRP3 炎症小体的激活，导致慢性炎症反应，最终驱动神经元变性、丢失。GORDON 等［24］发现，PD 患者脑黑质组织中NLRP3 炎症小体组成部分NLRP3、ASC、Caspase-1 升高，并与反应性小胶质细胞共定位；随后在PFF小鼠模型—一种模拟α-突触核蛋白病理的动物模型中发现，在神经病理早期阶段能检测到NLRP3 炎症小体，而动物口服MCC950 能减弱NLRP3 炎症小体的激活以及Caspase-1、IL-1β 的活化，并减少PFF 小鼠黑质纹状体中过度磷酸化的α-突触核蛋白聚集体的量；与对照组相比，MCC950 处理的小鼠多巴胺代谢物DOPAC 的含量、阳性神经元数量更高，在平衡木、悬线等运动实验中MCC950 组小鼠表现更好；这些结果表明，MCC950 通过抑制NLRP3/IL-1β 通路来减轻炎症反应，从而保护多巴胺能神经元，改善PD。CHENG 等［25］建立Atg5 敲除小鼠模型以模拟与PD 相关的行为学和病理学改变，证实小胶质细胞自噬缺陷导致NLRP3 炎症小体通过激活PDE10AcAMP 信号通路，上调下游IL-1β，导致巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）的表达增加，进一步驱动炎症反应；而小分子抑制剂MCC950 可显著抑制NLRP3 炎症小体的激活，减少了MIF的表达和神经炎症水平，并缓解了小鼠脑黑质中TH 神经元的损伤。因此，MCC950 有望继续成为一种新的治疗手段来治疗PD。

2.2 MCC950 在AD 治疗中的作用机制 AD 是一种最常见的神经退行性疾病，患者会发生记忆丧失和认知功能衰退。目前已知的AD 的病理生理学特征包括细胞外淀粉样蛋白-β（amyloid-β，Aβ）的积累、细胞内高磷酸化tau 蛋白的过度表达、神经纤维缠结和和慢性神经炎症［26］。近年来，越来越多证据表明NLRP3炎症小体在AD 的发生发展中起着重要的作用。研究［27］发现，Aβ 可以激活小胶质细胞、星形胶质细胞中的NLRP3 炎症小体，导致下游促炎因子IL-1β 和IL-18 释放，并在疾病发生发展过程中持续激活，最终导致神经功能障碍。FEKETE 等［28］通过给大鼠脑室输注Aβ 寡聚体建立AD 模型，在Aβ寡聚体输注4 周后可触发小胶质细胞激活，并检测到NF-κB/NLRP3 通路的活化。此外，Aβ 诱导后下调Esr1、Scn1a 基因会干扰抑制性中间神经元的功能，导致神经功能障碍。随后研究者给予大鼠长达四周的MCC950 治疗，治疗后大鼠体内IL-1α、TNF-α、IL-10 和IFN-γ 水平下降。Cd86 的转录是小胶质细胞表型调节的关键参与者，在MCC950 治疗后小胶质细胞上此受体的表达减少，并逆转了Esr1和Scn1a 基因的下调。在空间记忆的行为学实验中，MCC950 组相比于对照组表现更好。以上结果提示，MCC950 通过阻断NLRP3 炎症小体激活逆转Aβ诱导的体内炎症反应的发生来改善AD。有研究表明，NLRP3 炎症小体的激活是连接免疫功能、炎症和新陈代谢的关键点。在FINUCANE 等［29］建立的AD 体外模型中，用LPS 和Aβ 刺激巨噬细胞可促进磷酸果糖-2 激酶/果糖-2，6-双磷酸酶3（PFKFB3）的表达增加，并促进相关代谢重编程，转向促进糖酵解的表型，此转变有助于炎症小体的活化；加入MCC950 后减少了巨噬细胞中PFKFB3 的表达、IL-1β 的活化，逆转其向糖酵解的代谢转变；表明MCC950 通过抑制NLRP3 炎症小体介导的IL-1β-PFKFB3 轴，从而对糖酵解产生影响。综上，MCC950 可以在不同情况下抑制NLRP3炎症小体的激活来阻断AD 相关病理变化，在AD 的治疗中具有潜在的应用前景。

2.3 MCC950 在TBI 治疗中的作用机制 TBI 是全球人口死亡和残疾的最常见原因之一。TBI 可导致应激障碍、慢性神经炎症和慢性创伤性脑病，其中炎症反应是TBI 后继发性脑损伤的重要病理机制之一。研究［30］报道，在损伤脑组织的神经元神经胶质细胞中检测到NLRP3 炎症小体，其可诱导神经炎症反应和神经元死亡，加重脑神经组织的损伤，在TBI的发生发展中起着关键作用。在ISMAEL 等［31］构建的TBI 小鼠模型中，经MCC950 处理后可改善小鼠TBI 后72 h 神经严重程度的评分，减少Caspase-1、IL-1β 的产生，同时脑组织中凋亡相关蛋白PARP 和Caspase-3 活化显著降低，提示MCC950 阻断TBI 病灶处的神经凋亡来产生神经保护作用。XU 等研究［32］发现，NLRP3 炎症小体在脑外伤后表达增加，并主要分布于小胶质细胞中；经MCC950 处理后小胶质细胞中NLRP3 的免疫荧光染色显著降低；此外，MCC950 的应用具有神经保护作用，具体表现为脑水肿和病灶面积减少，运动和认知功能得到显著改善，并证明MCC950 的神经保护作用机制与白细胞募集受阻、小胶质细胞活化水平降低及相关的致炎细胞因子产生减少有关；在研究中，MCC950 还可逆转由脑外伤所致紧密连接claudin-1、ZO-3、TJ 的下降，提示MCC950 有助于维护血脑屏障的完整性。在CHEN 等［33］构建的机械创伤模型中，损伤发生3 h后检测到NLRP3 炎症小体mRNA 和蛋白表达升高，将MCC950 与雷帕霉素联合应用后NSS 评分、TUNEL 染色阳性面积均下降50%以上，TBI 后脑含水量从81.97%降至75.00%，提示MCC950 具有神经保护作用。此外，研究者采用体外OGD/R 模型（葡氧剥夺模型）模拟TBI后的缺氧环境，暴露于OGD后神经元中NLRP3、IL-1β mRNA 表达水平上升，LDH释放和ROS 含量升高，并呈现时间依赖性，提示炎症发生与线粒体损伤；MCC950 与雷帕霉素联合应用后经CoIP 检测发现，NLRP3 炎症小体组成部分及炎症介质表达减少，LDH 和ROS 含量降低，表明MCC950与雷帕霉素的协同作用有利于OGD 模型中神经元的线粒体功能恢复。

2.4 MCC950 在癫痫治疗中的作用机制 癫痫是一种由脑部神经元异常放电所致的临床综合征，是最常见的严重慢性脑部疾病之一，影响全球超过7000 万人，目前原因尚未完全明确。近年来，越来越多的证据［34］表明神经炎症可增强神经元兴奋性，促进癫痫发作。有文献［35］报道，难治性颞叶癫痫患者外周血IL-1β、脑皮质NLRP3 的表达水平高于对照组。另外，近期一项研究［36］表明，NLRP3 炎症小体通过调节环磷酸腺苷效应元件结合蛋白/SP1 转录因子通路来增强腺苷激酶（ADK）的表达，从而加速小鼠癫痫的发生发展，表明NLRP3 与癫痫发病机制关系极为密切。SHEN 等［35］将人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞暴露于游离Mg2+溶液以模拟癫痫细胞模型，发现模型建立后NLRP3 炎症小体的表达会增加，用MCC950 处理后NLRP3 炎症小体表达降低，神经元丢失被显著抑制，神经元凋亡减轻。在YUE 等［37］收集的人类颞叶皮层组织的灰质神经元内中通过免疫组化检测到NLRP3、ASC 和Caspase-1的产生，并与GRP2、PERK、p-PERK、eIF4α、peIF2α、ATF2 和CHOP 等内质网应激标志物共定位，在给小鼠注射毛果芸香碱前用50 mg/kg 剂量的MCC950 进行预处理，模型建立后进行免疫荧光和蛋白质印记分析，结果发现MCC950 逆转炎症因子和内质网应激标志物的产生。内质网应激被认为是细胞凋亡的主要触发因素，神经元凋亡和丢失可能以导致癫痫的发生和发展。而MCC950 治疗可以削弱内质网应激，从而对癫痫产生治疗作用。

综上所述，NLRP3 炎症小体是目前研究最为深入的炎症小体，参与多种中枢神经系统疾病的发生发展，NLRP3 炎症小体激活后经过一系列的级联反应，释放大量的炎症介质，促进疾病进展。因此，在未来的研究中，MCC950 治疗疾病的作用机制及临床作用需要继续探索。