亮斑扁角水虻幼虫生物转化对鸡粪中FAdV-4的消减作用研究

陈 帅,严婷婷,董梦瑶,周煜琛,佘望军,李 月,蔡珉敏,黄 凤,张吉斌,喻子牛,郑龙玉

(华中农业大学,湖北 武汉 430070)

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)会导致肉鸡心包积水综合征(hydropericardium syndrome,HPS)的发生,是目前对养鸡业危害最严重的疾病之一。自1987年首次爆发于巴基斯坦后,FAdV-4已经蔓延到了亚洲、中美洲、南美洲、欧洲的许多国家和地区[1-4]。FAdV-4主要感染3～8周的肉鸡,发病率和死亡率高达20%～80%[5-7]。垂直传播是FAdV-4 传播的重要途经,该病毒主要发生在未接种疫苗的种鸡中,随后通过受感染的鸡蛋垂直传播给肉鸡[8-9]。FAdV-4也易发生水平传播,因为该病毒存在于所有排泄物中,并且在粪便中的滴度很高。通常FAdV-4可以通过粪口途径和气溶胶在鸡群中有效传播[10-12]。污染物、人员和交通工具也可能是该病毒传播的重要因素[13]。

随着市场对鸡蛋和肉制品需求的增加,家禽业已发展为全球增长最快的农产业之一[14]。近年来,集约商业化禽类养殖迅速发展,鸡粪大量积累引发的环境污染问题日益凸显,其中病原体也给家禽甚至人类健康带来潜在威胁。目前,常采用堆肥、厌氧消化以及生物转化等方法处理家禽粪便,能很大程度上减少污染和疾病传播,并且能够产生能源和其它高附加值产品[15-17]。

亮斑扁角水虻(HermetiaillucensL.,black soldier fly,简称水虻),是一种新兴的资源化昆虫。在自然界中水虻幼虫(black soldier fly larvae,BSFL)营腐生生活,基于这一特性,其被用于转化畜禽粪便、餐厨垃圾等有机废弃物[18-19]。与家蝇不同的是,水虻很少与人类共享生活区域,从而降低了传播疾病的风险[20-21]。 BSFL转化能够减少粪便中的病原体沙门氏菌和病毒[22],不仅能解决环境污染的问题,还可以提高资源利用率。鉴于此,作者将BSFL接入含FAdV-4的鸡粪中(0～18 d),采用TaqMan qPCR和16S rDNA高通量测序分析BSFL转化过程中 FAdV-4含量的动态变化和微生物区系演化,以期为后续利用BSFL转化消减鸡粪中FAdV-4含量、抑制病原体传播风险提供理论支撑。

1 实验

1.1 材料

水虻为武汉品系,饲养于华中农业大学微生物农药国家工程研究中心5楼温室中。采用小麦麸皮与次粉按质量比1∶3配制成人工饲料,湿度保持在 70%～80%,饲养温度在(28±2) ℃左右,光周期设置为 14 L∶10 D。

FAdV-4,由华中农业大学动物医学院预防兽医学系提供。

1.2 FAdV-4的培养

FAdV-4分离自病鸡的鸡肝组织,剪碎鸡肝后加液氮研磨,用生理盐水稀释,8 000 r·min-1离心 5 min,取上清分装后冻存于-80 ℃冰箱中。使用鸡肝癌细胞LMH对FAdV-4进行传代培养;待癌细胞LMH生长至培养瓶面积80%左右时,开始接毒。于超净台内,弃去T75培养瓶中原培养液,用PBS洗涤2次,沥干。向T75培养瓶中加入5 mL 1640培养基(含2%FBS,下同),再加入200 μL病毒液,孵育1～2 h;补充5 mL 1640培养基,摇晃几次后将T75培养瓶置于培养箱中。每12 h观察细胞病变,待细胞病变达到80%时,开始收毒。将T75培养瓶置于-80 ℃冰箱中反复冻融2次,吸取病毒液于50 mL离心管中,4 ℃、6 000 r·min-1离心1 h,取上清;使用0.22 μm过滤器过滤病毒液,分装后冻存于-80 ℃冰箱中。接毒和收毒过程中所用相关器材及细胞废液均进行高压蒸汽灭菌。

1.3 添加FAdV-4物料转化体系

1.3.1 添加FAdV-4鸡粪转化体系

称取新鲜鸡粪400 g分装至9个2 L的小桶中,将FAdV-4添加至处理组和对照组(CK)鸡粪中,空白组鸡粪中不加FAdV-4,充分搅拌均匀,用5点采样法取约5 g鸡粪作为第0 d样品。向处理组和空白组鸡粪中加入400头7日龄BSFL,用4层医用纱布覆盖;每6 d在Ⅱ级生物安全柜中取样检测鸡粪中FAdV-4含量,探究BSFL在转化鸡粪过程中对FAdV-4含量的影响。取样完成后,取样工具及产生的废弃物均进行高压蒸汽灭菌。

1.3.2 添加FAdV-4人工饲料转化体系

将FAdV-4(含量9.75 log10copies·g-1)添加至200 g人工饲料中,处理组加入200头6日龄BSFL,对照组(CK)不加BSFL,每组做3个重复。每天取样检测人工饲料中的FAdV-4含量,探究BSFL在转化人工饲料过程中对FAdV-4含量的影响。

将FAdV-4(含量9.75 log10copies·g-1)添加至200 g人工饲料中,处理组分别加入400头和800头8日龄BSFL,对照组不加BSFL,每组做3个重复。每天取样检测人工饲料中的FAdV-4含量,进一步探究BSFL转化能力加强后对体系中FAdV-4消减效果的影响。

1.4 FAdV-4的含量检测

1.4.1 引物设计

参考相关文献中的引物并进行电泳和测序验证以优化碱基设计,得到实时荧光定量PCR(qRCR)所用引物[23],引物和探针均由北京擎科生物技术有限公司合成。引物序列如下：F4F1：5′-TTACGCTTACGGTGCCTACGT-3′;F4R1：5′-CCGCGTTATTCATGATCCAGTA-3′ (89 bp);探针序列如下：FAM-CGACGGTTCCCAGTCCCTCACG-BHQ1。

1.4.2 病毒核酸提取方法的优化

为了解决鸡粪中核酸提取效果较差、核酸容易降解的问题,准确定量鸡粪中病毒核酸的含量,对鸡粪样品的处理和核酸提取方法进行优化。首先称取各组鸡粪1 g左右,加入3 mL生理盐水,旋涡振荡使其混匀,立即8 000 r·min-1离心20 min;吸取300 μL上清,使用天根生化科技(北京)有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)提取核酸,洗脱操作有所调整,具体如下：向吸附膜滴加20 μL RNase-free ddH2O,盖上盖子,室温放置5 min后13 000 r·min-1离心1 min,再滴加20 μL RNase-free ddH2O,重复操作1次,以提高核酸的洗脱率。将提取的核酸保存于-80 ℃冰箱中或置于冰上立即使用。使用粪便基因组DNA提取试剂盒(DP328)提取BSFL转化后鸡粪中的病毒DNA。

1.4.3 病毒cDNA合成

病毒RNA反转录使用南京诺唯赞生物科技有限公司的HiScript®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)试剂盒,具体操作如下：在1.5 mL RNase-free离心管中加入3 μL病毒RNA,再加入5 μL RNase-free ddH2O;65 ℃加热5 min,迅速置于冰上骤冷,并在冰上静置2 min。

1.4.4 TaqMan qPCR程序

FAdV-4质粒检测 qPCR 体系如下：10 μL 2×AceQ U+ Probe Master Mix;6.5 μL RNase-free ddH2O;0.5 μL/0.5 μL Primer F/R;0.5 μL TaqMan Probe;2 μL Plasmid Template。qPCR 反应程序为：污染消化37 ℃ 2 min;预变性95 ℃ 10 min;变性95 ℃ 15 s,退火延伸60 ℃ 45 s,共40个循环。延伸阶段结束时记录荧光信号,使用Origin 2017绘图软件绘制标准曲线。

1.5 FAdV-4在BSFL消化道的分布检测

将3组30头7日龄BSFL放入20 g含FAdV-4的人工饲料中饲养;转化2 d后,对BSFL的消化系统进行取样,包括前胃段(从头部到前肠)、中肠段和马氏管至后肠段。将各分段组织进行液氮反复冻融后提取核酸,特异性PCR后采用琼脂糖凝胶电泳检测,评估BSFL转化物料过程中FAdV-4在BSFL肠道中的分布情况。

1.6 鸡粪菌群16S rDNA测序分析

对BSFL转化未添加FAdV-4的鸡粪空白组第0 d、第18 d的样品(B0、B18)、BSFL转化添加FAdV-4的鸡粪处理组第6 d、第12 d、第18 d样品(F06、F12、F18)以及只添加FAdV-4的鸡粪对照组第6 d、第12 d、第18 d样品(FC06、FC12、FC18)进行 16S rDNA测序和多样性分析(上海美吉生物医药科技有限公司)。使用美吉生信云平台(http：//cloud.majorbio.com)对测序结果进行分析和制图。

2 结果与讨论

2.1 BSFL转化添加FAdV-4鸡粪

将鸡粪样品每6 d取样提核酸后,采用TaqMan qPCR检测BSFL转化过程中鸡粪中FAdV-4含量,结果如图1所示。

图1 BSFL转化过程中鸡粪中FAdV-4的含量变化Fig.1 Change of FAdV-4 content in chicken manure during BSFL transformation

由图1可知,转化18 d,BSFL处理组的鸡粪中 FAdV-4 减少率(99.63%)明显高于对照组(64.74%),表明BSFL转化可以显著降低鸡粪中FAdV-4含量。

2.2 BSFL转化添加FAdV-4人工饲料

利用200头6日龄BSFL转化添加FAdV-4的人工饲料8 d,并分别利用400头8日龄和800头8日龄BSFL转化添加FAdV-4的人工饲料5 d,采用TaqMan qPCR检测BSFL转化过程中人工饲料中FAdV-4含量,结果如图2所示。

图2 BSFL转化过程中人工饲料中FAdV-4的含量变化Fig.2 Change of FAdV-4 content in artificial materials during BSFL transformation

由图2可知,与BSFL-200-6处理组的FAdV-4减少率(99.61%)相比,BSFL-400-8处理组(99.95%)和BSFL-800-8处理组(99.99%)的FAdV-4减少率更高,BSFL-800-8处理组第3 d就达到了BSFL-200-6处理组第8 d的病毒消减效果。表明,BSFL在转化人工饲料中能显著减少FAdV-4含量,且BSFL的转化能力得到加强后对人工饲料中FAdV-4的消减效果更显著。

2.3 水虻虫粪对FAdV-4的消减效果

为了评估转化后的物料是否影响FAdV-4的生存,分别称取50 g未灭菌的BSFL转化后的人工饲料(WMJ)及灭菌的BSFL转化后的人工饲料(MJ),分装至6个小白桶中,分别加入一定量的 FAdV-4 病毒液,每2 d取样提核酸后,采用TaqMan qPCR检测FAdV-4含量,结果如图3所示。

图3 转化后人工饲料中FAdV-4的含量变化Fig.3 Change of FAdV-4 content in artificial materials after BSFL transformation

由图3可知,在第6 d,未灭菌的转化后人工饲料(WMJ)中FAdV-4减少率为94.09%,而灭菌的转化后人工饲料(MJ)中FAdV-4减少率仅23.49%。表明,BSFL转化后物料能显著促进FAdV-4的消减,并且转化后物料中的微生物可能对BSFL的消减发挥了重要作用。

2.4 FAdV-4在BSFL消化道中的分布

采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,结果如图4所示。

M.50 bp marker 1～3.前胃段 4～6.中肠段 7～9.马氏管至后肠段

由图4可知,BSFL中肠段中明显检测到FAdV-4的存在,前胃段和马氏管至后肠段中FAdV-4检测无明显条带。表明,当BSFL摄入FAdV-4时,BSFL中肠的消化功能和微环境可能会破坏病毒结构,促进对FAdV-4的消减作用。

2.5 BSFL转化鸡粪中细菌多样性分析

2.5.1 鸡粪中细菌OTU水平聚类结果分析

各组鸡粪样品细菌群落在OTU水平上的Alpha多样性分析结果如图5所示。

图5 细菌群落在OTU水平上的Alpha多样性Fig.5 Alpha diversity of bacterial community at OTU level

由图5可知,各组样品微生物多样性随转化时间延长呈递减趋势。第18 d,ACE指数大小顺序为：F18

各组鸡粪样品基于OTU水平的Venn图如图6所示。

图6 细菌群落基于OTU水平的Venn图Fig.6 Venn diagram of bacterial community at OTU level

由图6可知,样品B0的OTU数量(692)最高,样品F18的OTU数量(568)最低。OTU组成差异最大的2组样品为B0和F18,共有OTU数量为404个,各自独有OTU数量为452个;OTU组成差异最小的2组样品为B18和F18,共有OTU数量为447个,各自独有 OTU数量为 322个。表明,与非处理对照组相比,BSFL转化鸡粪后能显著降低鸡粪中细菌多样性。

2.5.2 鸡粪中细菌在门水平上的组成及差异

各组鸡粪样品中细菌在门水平上的丰度如图7所示。

图7 细菌在门水平上的丰度Fig.7 Abundance of bacteria at phylum level

由图7可知,各组样品的细菌在门水平的主要分类为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、变形菌门(Proteobacteria)、异常球菌-栖热菌门(Dei-nococcus-Thermus)、放线菌门(Actinobacteria)等,其中厚壁菌门和拟杆菌门的微生物占绝对优势。转化过程中,各组样品的厚壁菌门微生物丰度均下降,第18 d,F18(18.52%)

2.5.3 鸡粪中细菌在属水平上的组成及差异

各组鸡粪样品中细菌在属水平上的热图如图8所示,各组鸡粪样品中细菌在属水平上前10的丰度如表1所示。

表1 各组鸡粪样品中细菌在属水平前10的丰度/%

图8 细菌在属水平上的热图Fig.8 Heat map of bacteria at genus level

由图8可知,大多数组样品其拟杆菌门分类下的各属丰度随转化时间延长而明显升高,同时厚壁菌门分类下的大多数属丰度随转化时间延长明显降低。由表1可知,不同样品部分属物种丰度变化趋势在不同时期差异较明显。苏黎世杆菌属(Turicibacter)的细菌在处理组样品F12、F18中丰度均降低,而在对照组中其丰度无明显变化。居绿藻菌属(Ulvibacter)微生物丰度在处理组样品F12、F18中均升高,转化后期样品F18中其丰度为21.86%,样品B18中其丰度达到了15.74%,表明该菌可能在转化鸡粪过程中与BSFL有协同作用,共同促进了有机废弃物的降解。嗜蛋白菌属(Proteiniphilum)微生物丰度在转化过程中先升高后降低,在转化中期的样品F12中,其丰度达到最高,为12.35%。推测嗜蛋白菌属可能以转化过程中死亡的微生物为食,在转化中期含量达到最高,该菌属的大量繁殖使得鸡粪中蛋白酶含量升高,从而促进FAdV-4蛋白质外壳降解,使FAdV-4含量降低。异常球菌-栖热菌门的特吕珀菌属(Truepera) 在BSFL转化含FAdV-4的鸡粪中丰度逐渐升高,在样品F18中其丰度最高,达到21.12%,表明该时期生存环境可能较为恶劣,多数菌类生长受到抑制,而该菌由于出色的耐受性而丰度升高。随转化时间延长,BSFL处理组中假单胞菌属(Pseudomonas)维持在较低丰度,而对照组中其丰度逐渐升高,在后期对照组样品FC18中其丰度达到 10.28%。表明,BSFL转化会抑制体系中假单胞菌生长。

2.5.4 鸡粪中细菌在属水平冗余分析

各组鸡粪样品中细菌(属水平丰度前10物种)在属水平冗余分析如图9所示,其中主坐标RDA1和RDA2差异贡献值分别为19.06%和8.88%。

图9 各组鸡粪样品中细菌在属水平冗余分析Fig.9 Redundancy analysis of bacteria in each chicken manure groups at genus level

由图9可知,FAdV-4消减量与各组样品pH值变化无显著相关,处理组样品F12、F18与FAdV-4消减量呈正相关。其中居绿藻菌属(Ulvibacter)、特吕珀菌属(Truepera) 细菌丰度变化与FAdV-4消减量呈正相关且相关性较大,苏黎世杆菌属(Turicibacter)、泰氏菌属 (Tissierella)、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌丰度变化与FAdV-4消减量呈负相关。表明,居绿藻菌属、特吕珀菌属在BSFL转化体系中与FAdV-4消减密切相关,BSFL转化系统在消减FAdV-4的同时能够降低苏黎世杆菌属、泰氏菌属、假单胞菌属的丰度。

3 结论

研究了BSFL转化对鸡粪中禽类典型病毒FAdV-4的消减作用。结果表明,BSFL转化能够显著消减鸡粪中的FAdV-4群体载量,并且增加BSFL接种量和日龄能够增强其对FAdV-4的消减作用。BSFL转化使物料中的细菌多样性显著降低,其中居绿藻菌属、特吕珀菌属与FAdV-4消减量呈正相关且相关性较大,推测这2类细菌与BSFL协同参与了对FAdV-4的影响过程。由此表明BSFL生物转化技术能够在资源化利用鸡粪等有机废弃物的同时,在一定程度上实现有机废弃物的无害化,减少病原体的传播风险。