结直肠癌组织KRT15、KRT18蛋白表达与临床病理特征和预后的关系分析*

孟俊宏,高明悦,龚 程,张小雅,石文杰,刘杜先△

南京中医药大学附属南京医院/南京市第二医院:1.病理科;2.胃肠治疗中心,江苏南京 210003

结直肠癌是我国常见的高病死率、易复发、易转移的恶性消化系统肿瘤,随着膳食结构的改变和人们生活水平的提高,结直肠癌患病率不断增加,尽管近年来结直肠癌诊疗技术取得了显著的提升,患者生存率有所提高,但是由于我国结直肠癌早期诊断率低,生存率依然低于其他一些国家[1]。临床多通过TNM分期、分化程度、转移状态等病理特征评估结直肠癌患者预后,但即便是处于同一分期的患者预后也存在一定差异。因此,寻找新的生物标志物有望对相同分期结直肠癌患者预后做出更准确的判断,指导其后续系统性治疗[2]。角蛋白15(KRT15)蛋白是一种表皮细胞的结构蛋白,属于角蛋白家族中的Ⅰ型角蛋白,有助于维持细胞质稳定和损伤后的上皮再生,有研究显示,KRT15蛋白可促进结直肠癌细胞的迁移和入侵[3]。角蛋白18(KRT18)蛋白是一种Ⅰ型中间丝蛋白,有研究显示,可通过抑制KRT18蛋白/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路抑制结肠癌的进展[4]。本研究旨在探讨结直肠癌组织KRT15、KRT18蛋白表达与临床病理特征和预后的关系,以期为临床预后分析提供新的生物标志物。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年6月至2019年6月本院收治的97例行手术治疗的结直肠癌患者作为研究对象,男52例、女45例。研究对象按年龄均值分层:年龄≥65岁50例,年龄<65岁47例;病理类型:腺癌71例,黏液腺癌26例;分化程度:低分化53例,中分化30例,高分化14例;TNM分期:Ⅰ期27例,Ⅱ期40例,Ⅲ期30例;肿瘤最大径:>5 cm 46例,≤5 cm 51例;术前癌胚抗原(CEA)≥5 ng/mL 33例,CEA<5 ng/mL 64例;神经侵犯:有神经侵犯26例,无神经侵犯71例。纳入标准:(1)经术后病理证实为结直肠癌;(2)TNM分期Ⅰ～Ⅲ期;(3)具备手术指征,手术均由同一组医师操作完成;(4)术前未接受任何新辅助放化疗;(5)临床资料完整;(6)自愿签署知情同意书。排除标准:(1)合并其他恶性肿瘤;(2)接受保守治疗;(3)既往有腹部手术史或反复住院。本研究已经获得本院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1癌组织和癌旁组织样本收集 取手术切除的新鲜癌组织和癌旁组织(距离癌组织5 cm以上)置于4 ℃固定液中固定3～6 h,无水乙醇梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片机切成4 μm切片。

1.2.2免疫组化法检测KRT15、KRT18蛋白表达 将4 μm切片常规脱蜡和复水,10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液孵育10 min,微波20 min。0.3% H2O2处理抑制内源性过氧化物酶活性,5%脱脂奶粉孵育阻断非特异性结合。PBS冲洗两次,每次5 min,加入一抗细胞KRT15多克隆抗体(1∶1 000稀释,美国Invitrogen公司)、KRT18抗体(1∶250稀释,美国Abcam公司)4 ℃孵育过夜,加入靶向IgG分子的重链和轻链二抗山羊抗兔IgG(1∶400稀释,美国Invitrogen公司)孵育90 min。ABC溶液孵育30 min,3,3′-二氨基联苯胺染色5 min,苏木精反染色,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶密封。显微镜下观察,以磷酸盐缓冲生理盐水代替一抗作为阴性对照,以细胞质或者细胞核中出现棕色或者黄色即为阳性。

1.3观察指标 所有患者出院后均定期接受电话随访和门诊复查(结肠镜检查、胸、腹部和盆腔增强CT、血常规、生化及肿瘤标志物检测),术后第1～2年每3个月随访1次,术后第3年每6个月随访1次,共随访3年,统计3年总生存期(OS)情况。OS为病理确诊至死亡或随访截止时间。3年OS率=随访3年结肠癌患者的生存例数/总例数×100%。

1.4统计学处理 采用统计软件SPSS25.00进行数据分析,KRT15、KRT18蛋白阳性表达率等计数资料以n(%)表示,行χ2检验。采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验分析不同KRT15、KRT18蛋白表达的结直肠癌患者3年OS率的差异,单因素和多因素COX风险比例回归分析影响结直肠癌生存的因素。检验水准α=0.05。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1结直肠癌组织和癌旁组织KRT15、KRT18蛋白阳性表达率比较 免疫组化检测结果显示KRT15、KRT18蛋白主要在细胞质中表达,结直肠癌组织中KRT15、KRT18蛋白染色以淡棕色或深棕色为主,癌旁组织中KRT15、KRT18蛋白染色未见黄染,见图1、2。结直肠癌组织中KRT15、KRT18蛋白阳性表达率高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

注:A为KRT15蛋白在癌旁组织中呈阴性表达;B为KRT15蛋白在结直肠癌组织中呈低表达;C为KRT15蛋白在结直肠癌组织中呈高表达。

注:A为KRT18蛋白在癌旁组织中呈阴性表达;B为KRT18蛋白在结直肠癌组织中呈低表达;C为KRT18蛋白在结直肠癌组织中呈高表达。

表1 结直肠癌组织和癌旁组织KRT15、KRT18蛋白阳性表达率比较[n(%)]

2.2不同临床病理特征结直肠癌组织中KRT15、KRT18蛋白阳性表达率比较 低分化、TNMⅢ期、有神经侵犯、术前CEA≥5 ng/mL的结直肠癌患者癌组织中KRT15、KRT18蛋白阳性表达率高于中、高分化、TNMⅠ～Ⅱ期、无神经侵犯、术前CEA<5 ng/mL的结直肠癌患者,差异有统计学意义(P<0.05)。不同年龄、性别、病理类型、肿瘤最大径的结直肠癌患者癌组织中KRT15、KRT18蛋白阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同临床病理特征结直肠癌组织中KRT15、KRT18蛋白阳性表达率比较[n(%)]

2.3KRT15、KRT18蛋白阳性及阴性表达结直肠癌患者3年OS率比较 随访期间死亡24例,无失访病例。KRT15、KRT18蛋白阳性表达的结直肠癌患者3年OS率依次为64.29%、60.00%,低于KRT15、KRT18蛋白阴性表达的结直肠癌患者3年OS率(依次为83.64%、85.96%),差异有统计学意义(χ2=6.497、7.987,P<0.05)。见图3。

图3 不同KRT15、KRT18蛋白表达结直肠癌患者3年OS率生存曲线

2.4影响结直肠癌患者预后的COX风险比例回归分析 以结直肠癌患者预后为因变量(赋值:0=生存,1=死亡),以年龄(赋值:0=<65岁,1=≥65岁)、性别(赋值:0=女,1=男)、肿瘤最大径(赋值:0=<5 cm,1=≥5 cm)、病理类型(赋值:0=腺癌,1=黏液腺癌)、分化程度(赋值:0=中、高分化,1=低分化)、TNM分期(赋值:0=Ⅰ～Ⅱ期,1=Ⅲ期)、神经侵犯(赋值:0=无,1=有)、术前CEA(赋值:0=<5 ng/mL,1=≥5 ng/mL)、KRT15蛋白表达(赋值:0=阴性表达,1=阳性表达)、KRT18蛋白表达(赋值:0=阴性表达,1=阳性表达)为自变量。单因素COX风险比例回归分析结果显示,低分化、TNMⅢ期、有神经侵犯、术前CEA≥5 ng/mL、KRT15蛋白阳性表达、KRT18蛋白阳性表达与结直肠癌患者预后有关(P<0.05)。多因素COX风险比例回归分析结果显示,TNMⅢ期、KRT15蛋白阳性表达、KRT18蛋白阳性表达是影响结直肠癌患者预后的危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响结直肠癌患者预后的COX风险比例回归方程

3 讨 论

结直肠癌是环境因素和遗传因素共同作用导致的世界范围内常见的消化道恶性肿瘤之一,尽管目前分子靶向治疗、免疫治疗研究有了显著的进展,并逐渐应用于临床,延长了患者的生存时间,但结直肠癌治疗后易发生远处转移或复发,患者长期OS率仍较低[5-6]。因此需要进一步寻找新的生物标志物和治疗靶点,以改善临床患者预后。研究显示角蛋白是一类位于上皮细胞主要的纤维状蛋白质,通过与上皮细胞之间的桥粒结合,维持组织屏障和细胞极性,参与细胞器和蛋白质的空间组织及细胞凋亡和迁移的调节,为表皮细胞提供支撑和保护功能,角蛋白突变与上皮细胞应激、增殖和凋亡、侵袭有关,被证实参与人类恶性肿瘤发生过程[7-8]。

KRT15蛋白是角蛋白家族中的细胞角蛋白成员之一,只存在于增生的表皮细胞基底层部位,被认为是基底部蛋白的支架成分之一,有助于表皮细胞基底层分层并提供支撑作用,KRT15蛋白还参与表皮干细胞的增殖和分化,常作为干细胞活化的标志物[9]。KRT15蛋白也是一种促癌角蛋白,其阳性表达率能反映肿瘤细胞增殖的速度,与多种恶性肿瘤发生和进展有关,有研究显示KRT15蛋白在子宫内膜癌组织中表达异常增高,其表达上调与子宫内膜癌患者淋巴血管侵犯、宫颈间质侵犯及预后不良有关[10]。在口腔鳞状细胞癌组织中也可检测到KRT15蛋白表达上调,在KRT15蛋白阳性表达的皮肤干细胞中,癌基因磷脂酰肌醇3激酶的p110a亚基过度激活,肿瘤抑制基因TP53表达下调,可促使免疫逃逸,导致皮肤鳞状细胞癌的发生和恶性进展[11-12]。本研究结果发现,结直肠癌组织中KRT15蛋白阳性表达率高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);TNMⅢ期、KRT15蛋白阳性表达、KRT18蛋白阳性表达是影响结直肠癌患者预后的危险因素(P<0.05)。可能的原因为KRT15蛋白阳性表达可能增强癌症干细胞特性,表现出较强的侵袭能力;其次,β-catenin/基质金属蛋白酶7(MMP-7)信号通路激活可促使上皮-间充质转化,增强癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,KRT15蛋白阳性表达可能通过激活β-catenin/MMP-7信号通路激活,显著促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭[13-15]。因此KRT15蛋白阳性表达可能促使结直肠癌淋巴血管侵犯,导致肿瘤恶性进展和预后不良的发生。

KRT18蛋白是细胞骨架蛋白中间丝家族的一员,在呼吸道和胃肠道的上皮细胞和内皮细胞中表达,从细胞核表面延伸到细胞膜,参与细胞周期调控,与细胞增殖、凋亡、运动和细胞信号转导等多种细胞过程有关,对维持组织完整性至关重要[16]。KRT18蛋白被发现在前列腺癌、浸润性乳腺癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中异常表达,并与TNM分期、临床进展和预后相关[17-19]。DREW等[20]应用多重基因表达检测方法检测到结肠正常组织与结肠腺瘤息肉组织中KRT18蛋白表达明显低于结肠癌组织。本研究结果显示,结直肠癌组织中KRT18蛋白阳性表达率高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);TNMⅢ期、KRT15蛋白阳性表达、KRT18蛋白阳性表达是影响结直肠癌患者预后的危险因素(P<0.05),表明KRT18蛋白阳性表达可能与结直肠癌的恶性病理行为及肿瘤进展有关,在结直肠癌发病机制中可能发挥致促癌作用。有研究指出,MAPK信号通路是细胞增殖重要的通路之一,其激活可提高结肠癌细胞的增殖和生存能力,抑制癌细胞凋亡,KRT18蛋白表达上调可激活MAPK信号通路,促使结肠癌细胞的恶性增殖和侵袭[21-22]。另外Notch受体1(Notch1)是一个高度保守的细胞间信号转导系统,其可在结直肠癌中激活并促使癌细胞增殖和侵袭,结直肠上皮细胞中的KRT18蛋白可提高Notch1水平并稳定Notch1信号通路活性,促使结直肠癌细胞增殖,抑制其凋亡[23-24]。KRT18蛋白阳性表达可能通过MAPK、Notch1致癌信号通路促使结直肠癌恶性进展,导致患者预后不良。本研究为单中心研究,样本量相对较小,可能导致统计分析结果偏倚,其次本研究随访评估时间较短,有待扩大样本量、延长随访时间进一步研究证实。

综上所述,结直肠癌组织中KRT15、KRT18蛋白阳性表达率高于癌旁组织,TNMⅢ期、KRT15蛋白阳性表达、KRT18蛋白阳性表达是影响结直肠癌患者预后的危险因素,KRT15、KRT18蛋白有望成为结直肠癌新的预后预测生物标志物和治疗潜在靶点。