过量表达大豆异丙基苹果酸脱氢酶基因GmIPMDH 促进植株开花和生长

刘 薇 王玉斌 李 伟 张礼凤 徐 冉 王彩洁 张彦威

山东省农业科学院作物研究所 / 山东省特色作物工程实验室, 山东济南 250100

亮氨酸是一种重要的支链必需氨基酸, 只能在植物或微生物体内从头合成, 对哺乳动物骨骼肌蛋白周转、蛋白质合成、机体免疫功能和氧化供能等方面起到重要的生物学作用[1]。异丙基苹果酸合成酶(isopropylmalate synthase, IPMS)和异丙基苹果酸脱氢酶(isopropylmalate dehydrogenase, IPMDH)是亮氨酸生物合成中的重要限速酶。在IPMS 的作用下,α-羧基异戊酸与乙酰辅酶A 缩合形成α-异丙基苹果酸, 随后发生异构化形成β-异丙基苹果酸。β-异丙基苹果酸在IPMDH 的催化作用下进行脱羧反应形成α-羰基异己酸, 最后发生基于谷氨酸的转氨反应后形成产物亮氨酸[2]。

目前, 在水稻、油菜和拟南芥中对IPMS 基因进行了分离。拟南芥中, 3 个IPMS基因在根、叶、茎和花中都表达。缺少5′叶绿体引导序列的IMS2和IMS3能够补充大肠杆菌的亮氨酸营养素[3]。在水稻中,OsIPMS1参与调控了发芽种子中的淀粉水解、糖酵解活性和能量水平, 进而影响水稻发芽。同时, 研究发现在osipms1突变体中11 个与胁迫耐受、赤霉素生物合成和三羧酸(TCA)循环相关的基因表达量显著降低[4]。在拟南芥中过量表达油菜BrIPMS基因改变了拟南芥的氨基酸代谢, 提高了芥子油苷的含量[5]。在油菜、马铃薯和拟南芥中对IPMDH进行了分离和克隆[6-8], 但只有拟南芥中AtIPMDH基因的功能得到了验证。AtIPMDH1基因能够调节芥子油苷的氧化还原反应, 影响亮氨酸的生物合成[9]。同时有研究表明, 拟南芥中AtIPMDH2和AtIPMDH3不仅在亮氨酸生物合成中起作用, 对花粉发育也至关重要, 并且是胚胎囊发育所必需[10]。以上研究表明,IPMS和IPMDH在植物的生长发育中发挥了重要作用。

大豆是人类重要的植物蛋白质来源, 然而关于大豆亮氨酸合成途径的关键酶未见报道。本研究以拟南芥AtIPMDH2的大豆同源基因GmIPMDH为研究对象, 通过实时荧光定量PCR、遗传转化、转录分析等方法, 解析GmIPMDH的功能。研究发现GmIPMDH参与大豆花期和株型的调控。相关研究结果为大豆花期和株高改良提供了基因资源。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用大豆品种Williams 82 (Wm82)由本课题组保存; 转基因烟草受体品种Havana425 由东北农业大学大豆研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学分析 利用拟南芥基因AtIPMDH2的氨基酸序列, 在phytozome数据库(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)[11]进行序列比对,选取bitscore最高的基因作为本研究的目标基因。利用引物GmIPMDH-s和GmIPMDH-a(表1)克隆GmIPMDH的CDS序列, 扩增产物交由擎科生物技术有限公司测序; 利用CDD 在线分析软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)[12]进行氨基酸序列的保守结构域分析; 利用在线分析软件SOPMA (https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)[13]进行二级结构分析; 利用Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/)[14]预测蛋白的3D结构。在Phytozome数据库提取GmIPMDH上游2056 bp的序列作为启动子序列,并利用引物GmIPMDH-pro-s和GmIPMDH-pro-a进行启动子的克隆。通过在线分析网站PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[15]分析启动子的顺式作用元件。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2GmIPMDH基因的表达分析 大豆品种Wm82 种植在草炭土中, 于人工气候室(25℃, 12 h光照/12 h 黑暗)培养, 播种7 d 后挑选长势一致的大豆幼苗每盆定植3 株, 分别提取大豆播种15 d 后的根、茎尖、叶片、子叶和下胚轴和播种45 d 后的花和幼荚RNA 进行GmIPMDH的组织特异性表达分析;分别提取大豆播种12 d、15 d、18 d、21 d、24 d、27 d、30 d、33 d 叶片RNA 进行大豆营养生长阶段GmIPMDH的表达分析。参照诺唯赞生物科技股份有限公司植物RNA 抽提试剂盒(RC401-01)提取样品总RNA, 参照宝生物科技有限公司反转录试剂盒(RR047A)操作说明合成 cDNA 第 1 链。根据GmIPMDHCDS 序列信息, 利用NCBI Primer Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)[16]设计引物(表1), 利用Roche LightCycler 480II 进行荧光定量PCR, 采用相对定量法(2-ΔΔCt)[17]计算基因的表达水平。

1.2.3 转基因株系的获得 将GmIPMDHCDS 序列插入植物表达载体 pCambia3301 中, 构建pCambia3301-GmIPMDH过量表达载体。利用农杆菌介导的烟草叶盘法转化烟草受体 Havana425[18],利用农杆菌介导的大豆子叶节法[19]转化大豆受体Wm82。初步获得的阳性转基因株系利用PCR 和qPCR 法进行进一步的验证(表1)。

1.2.4GmIPMDH烟草过量表达植株的表型分析

烟草种子种植于1/2 MS 培养基中, 出苗后挑选长势一致的幼苗定植于营养土土中, 于人工气候室(28℃, 12 h 光照/12 h 黑暗)培养, 统计其花期及开花时株高。烟草花期以萌发至开花当天的天数记录。利用SPSS Statistics19 中的Student’st检验分析显著性差异。

1.2.5GmIPMDH大豆过量表达植株的表型分析

大豆种子种植在草炭土中, 于人工气候室(25℃,10 h 光照/14 h 黑暗)培养, 播种7 d 后挑选长势一致的大豆幼苗每盆定植2 株, 统计其花期(播种翌日至开花当天的天数)及开花时株高。利用SPSS Statistics 19 中的Student’st检验分析显著性差异。

1.2.6 大田条件下GmIPMDH大豆过量表达植株的表型分析 将Wm82 和GmIPMDH过量表达株系于2022 年6 月24 日种植于山东省济南市试验田(36°42'28″N, 117°05'19″E), 每个株系种3 行, 行长2 m, 株距10 cm, 行距50 cm。试验设3 次重复。统计各株系的开花天数(播种翌日至小区开花的株数达到50%)。利用SPSS Statistics19 中的Student’st检验分析显著性差异。

1.2.7 转基因大豆的转录组测序 大豆培养条件同1.2.2, 分别于播种14 d 和17 d 后选取Wm82 和GmIPMDH过量表达株系第1 片三出复叶中间叶片送交迈维代谢科技有限公司进行转录组测序, 每份样品9 株混样, 3 次重复。利用DESeq2 和Benjamini-Hochberg 方法筛选差异表达基因, |log2(Fold Change)|≥ 1, 且FDR ＜ 0.05。在SoyBase 数据库检索差异表达基因注释信息, 利用Uniprot 数据库(https://www.uniprot.org/)及基因对应的拟南芥同源基因的功能筛选出开花调控候选基因。

2 结果与分析

2.1 AtIPMDH2 同源基因GmIPMDH 的克隆和序列分析

将拟南芥基因AtIPMDH2(AT1G80560)序列提交至Phytozome 数据库进行比对, Glyma.15G005400的比对bitscore 最高, 为623.624, identity 为74%, 故对其进行后续研究。Glyma.15G005400 基因全长4121 bp, 含有9 个外显子和8 个内含子(图1-A)。提取Wm82 叶片RNA 并反转录, 以该cDNA 为模板对Glyma.15g005400 进行克隆并测序。结果表明CDS区全长1230 bp, 其编码的氨基酸从第43 个氨基酸到第400 个氨基酸为Iso_dh 亚家族保守结构域, 表明Glyma.15g005400 编码一个异丙基苹果酸脱氢酶(IPMDH), 故将该基因命名为GmIPMDH。对GmIPMDH 蛋白的二级结构和三级结构进行预测表明, 该蛋白主要以α 螺旋和无规则卷曲为主(图1-C,D)。其中α 螺旋占比为43.52%, 无规则卷曲占比为34.96%, 还含有少量的延伸连(13.45%)和 β 转角(8.07%) (图1-C)。

图1 GmIPMDH 序列分析Fig. 1 Sequence analysis of GmIPMDH

图2 GmIPMDH 的表达量Fig. 2 Relative expression pattern of GmIPMDH genes

根据大豆基因组信息, 克隆了GmIPMDH起始密码子上游2056 bp 的序列。启动子元件分析(表2)表明,GmIPMDH启动子中包括5 类光反应元件(G-box、BOX4、TCT-motif、AT1-motif 和3-AF1 binding site); 3 类激素应答元件, 分别是脱落酸应答元件(ABRE)、乙烯应答元件(ERE)和水杨酸应答元件(TCA); 2 个应激元件(STRE, WUN-motif)。同时,GmIPMDH还包括多个MYC 结合位点。

表2 GmIPMDH 启动子元件分析Table 2 Cis-elements of GmIPMDH promoter

2.2 GmIPMDH 的组织表达分析

为阐明GmIPMDH在不同组织的表达模式, 利用qRT-PCR 检测GmIPMDH在大豆根、茎、叶、子叶、下胚轴、花和荚的表达量。结果显示,GmIPMDH在各个部位均有表达, 在根、下胚轴、花和和幼荚表达量较高。同时, 检测了短日下不同天数GmIPMDH在叶片中的表达量, 结果显示,GmIPMDH在种植第12 天和第15 天时表达量较低, 从第18 天开始表达量上升, 第27 天表达量达到高峰, 随后下降。

2.3 异源表达GmIPMDH 改变烟草花期和株高

将烟草Havana425 和GmIPMDH烟草过量表达株系种植于人工气候室, 观察比较植株的开花时间。与野生型相比, ox-1、ox-5 和ox-21 的开花时间明显提前(图3-A, B), 3 个转基因株系花期分别提前57.1 d、45.8 d 和39.8 d (图3-B); 同时, ox-1、ox-5和ox-21 的株高显著提高(图3-C), 具体表现为节数的增加和节间距的增长(图3-A)。

图3 GmIPMDH 过量表达烟草表型Fig. 3 Phenotypes of tobacco with ectopic expression of GmIPMDH

2.4 温室短日和田间自然条件下过量表达GmIPMDH 大豆株系功能分析

选取GmIPMDH表达量相对较高的大豆过量表达T3代株系ox-4 和ox-5 (图4-B)于温室短日条件(10 h 光照/14 h 黑暗)培养, 观察并统计其花期表型。结果显示, 在温室短日照条件下, Wm82 开花时间为35.75 d, 而过量表达株系ox-4 和ox-5 的开花时间显著早于野生型 Wm82 (比 Wm82 平均提前 2.25～2.75 d); 播种36 d 后, Wm82 株高26.5 cm, 5.1 节, ox-4株系株高36.5 cm, 7.0 节, ox-5 株系株高34.5 cm, 6.8节。因此, 与野生型相比, 过量表达株系株高和节数均极显著提高(图4-A, D)。综上, 在温室短日照条件下,GmIPMDH过量表达大豆株系生长发育进程显著加速, 表现出花期提前、株高提高、节数增加的特性。

(图4)

将大豆过量表达T4代株系ox-4 和ox-5 种植于田间, 检测GmIPMDH的表达量并统计植株开花天数。在田间种植条件下, 过量表达株系中GmIPMDH表达量较Wm82 提高20～30 倍(图5-A); Wm82 花期为37.3 d, 比过量表达株系平均延迟3.0～3.5 d, 且达到了极显著水平(图5-B)。

图5 田间GmIPMDH 过量表达大豆株系的开花时间统计Fig. 5 Flowering time statistics of GmIPMDH overexpression lines in the field

2.5 转录组学分析

分别提取温室生长14 d 和17 d 的GmIPMDH过量表达大豆叶片RNA 进行转录组分析。GmIPMDH过量表达大豆植株与Wm82 野生型植株基因表达差异较大(图6-A, B)。在14 d 和17 d 分别检测到1210个和1768 个差异表达基因(图6-A, B)。其中, 14 d上调表达基因526 个, 下调表达基因684 个(图6-C);17 d 上调表达基因866 个, 下调表达基因902 个(图6-C)。表明随着大豆的生长发育, 检测到更多的差异表达基因。在14 d 和17 d 均检测到的差异表达基因225 个(图6-D)。对差异表达基因进行功能注释, 在14 d 检测到12 个花期相关差异表达基因(表3 和图6-E); 在17 d 检测到18 个花期相关差异表达基因(表3 和图6-F)。这些开花相关差异基因中,REF6、MED13、FPA、FD、PRR5、FKF1、GA3OX1等开花正调控因子上调表达,AGL18、ICE1、GA2ox1、GA2ox2、GA2ox8等开花负调控因子下调表达。同时, 我们还发现赤霉素合成相关基因表达量也发生了显著变化, 其中GA3ox1上调表达,GA2ox1、GA2ox2、GA2ox8下调表达(图6和表3)。

图6 GmIPMDH 过量表达大豆的转录组学分析Fig. 6 Transcriptome analysis of GmIPMDH overexpression soybean

表3 花期相关差异表达基因功能注释Table 3 Functional annotation of DEGs related to flowering time

3 讨论

异丙基苹果酸脱氢酶(IPMDH)是亮氨酸生物合成中的重要限速酶。在拟南芥中,AtIPMDH2和AtIPMDH3不仅在亮氨酸生物合成中起作用, 对花粉发育也至关重要, 并且为胚胎囊发育所必需[10]。但是,IPMDH参与开花期的研究未有任何报道。本研究对拟南芥AtIPMDH2在大豆中的同源基因GmIPMDH进行了克隆和分析。在营养生长阶段,GmIPMDH在早期表达量较低, 而在第18天开始上升, 第27天表达量达到高峰, 推测GmIPMDH可能与大豆的生长发育有关。在烟草的异位表达和大豆的过量表达均证明,GmIPMDH对开花期有正向调节作用。同时发现, 转GmIPMDH的大豆株系株高提高、节数增加。因此, 转GmIPMDH基因的大豆植株表现出较快的生长发育进程。

通过转录组测序发现了若干个开花期相关基因表达量的变化。这些开花基因可能是GmIPMDH改变大豆花期的原因之一。值得注意的是, 本研究发现了赤霉素相关基因GA3ox1、GA2ox1、GA2ox2、GA2ox8表达量的变化。赤霉素能够促进植物种子萌发、茎和根的伸长、叶片伸展、成花诱导、花粉发育,在植物的整个生命周期有着极为重要的作用[20-22]。GA生物合成代谢途径涉及多种酶, 其中GA3ox和GA2ox分别是催化赤霉素前体合成活性GAs和非活性GAs的关键限速酶, 在特定发育阶段维持植物内源GAs活性水平, 保证植物生长发育过程的正常进行[23-24]。GA3ox基因家族编码的氧化酶可以将GA9和GA20分别氧化为活性的GA4或GA1和GA3, 进而调节植物生长发育。有研究证明, 玉米矮化突变体gad39引起GA3ox蛋白功能不同程度的缺失, 导致活性赤霉素合成受阻, 进而造成植株矮化、分蘖增多,节间数减少, 雄穗、和节间长度降低等各种表型[25]。拟南芥TEM1通过直接调节GA3OX1和GA3OX2的表达, 整合光周期和GA依赖的开花途径, 调控拟南芥成花诱导[26]。赤霉素GA2ox蛋白是一种与GA失活相关的氧化酶, 可以催化活性GAs并将其转化为非活性产物, 是降低内源生物活性GA含量并导致植株半矮化和矮化的关键基因。其功能在一些植物中得到了验证: 麻风树异源表达JcGA2ox6导致拟南芥植株矮化、开花延迟, 在麻风树中过量表达引起内源性生物活性GA4的减少导致典型的矮化表型[27]; 桃树PpGA2ox基因家族通过微调桃的内源GA水平, 适当控制桃树的旺盛生长[28]。本研究中,GmIPMDH在烟草中异源表达及在大豆中的过量表达均导致植株花期提前、株高提高、节数增加、节间伸长。并且,GmIPMDH过量表达大豆中GmGA3ox的表达量显著提高, 而GmGA2oxs表达量显著降低。这些基因的变化可能引起大豆内源活性GAs含量的提高, 从而导致大豆花期提前、株高提高、节数增加。下一步需要进一步验证GmIPMDH参与GA调控大豆株高和成花诱导的分子机制。

4 结论

本研究对大豆异丙基苹果酸脱氢酶GmIPMDH进行了表达分析和功能验证, 通过异源表达烟草和过量表达大豆研究发现,GmIPMDH参与植物开花时间、株高和节数的调控, 转录组分析推测GmIPMDH可能是通过赤霉素合成通路参与赤霉素介导的植物开花诱导和株型调控。