(Pyr1) Apelin-13对布比卡因诱导停搏乳鼠心肌细胞PI3K/Akt通路的干预

林婷婷，陈超星，鲍娜娜，施克俭，董娇娇，刘乐

温州医科大学附属第一医院 麻醉科，浙江 温州 325015

布比卡因是临床上常见的酰胺类局部麻醉药，广泛用于局部浸润麻醉、硬膜外麻醉、神经阻滞等麻醉方法中[1]。但临床上操作不当致使布比卡因不慎入血或用量过大或机体高敏时，可能会引起严重的心脏毒性，造成循环衰竭甚至心脏停搏[2]。APJ受体是细胞膜上存在的一种七次跨膜G蛋白耦联受体，广泛分布于全身多个重要脏器，随后在1998年发现其特异性配体Apelin[3]。多年研究表明， Apelin/APJ系统有助于改善心力衰竭[4-5]、动脉粥样硬化[6]、心肌缺血再灌注损伤[7]、心律失常[8-9]、高血压[10]、心肌肥厚[11-12]等多种心血管系统疾病。前期本团队首次发现布比卡因诱导的在体大鼠心脏停搏模型中，Apelin-13 可明显提高大鼠复苏率及加快血流动力学恢复[13]。但截至目前，Apelin逆转布比卡因心肌毒性的具体机制尚未完全明确。本研究制备体外布比卡因诱导的乳鼠心肌细胞停搏模型，给予外源性（Pyr1）Apelin-13处理，观察其细胞搏动和线粒体改变情况，并探讨Apelin/APJ系统在布比卡因心肌毒性中的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠新生1～3 d的乳鼠，由温州医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（浙）2020-0001。

1.1.2 实验试剂 布比卡因（美国Sigma公司，B5274-5G）， （Pyr1）Apelin-13（美国Tocris公司，217082-60-5），大鼠Apelin-13酶联免疫试剂盒（上海Boyun Biotech公司，BP-E20321），乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，A020-2），兔抗GAPDH抗体（美国CST公司，#5174），兔抗APJ受体（美国Abcam公司，ab214369），兔抗PI3K抗体（美国CST公司，#4292），兔抗p-PI3K抗体（美国Affinity公司，#AF3241），兔抗Akt抗体（美国CST公司，#9272），兔抗p-Akt抗体（美国CST公司，#4060）

1.1.3 心肌细胞提取及培养 取SD大鼠乳鼠，用75%乙醇消毒后，剪开胸骨，迅速取出心脏置于预冷PBS中清洗。剪碎心室组织，加入心肌细胞消化液移至37 ℃水浴机械搅拌8 min，收集组织上方消化液至含10% FBS的DMEM培养液的离心管中终止消化，剩下组织再次加入消化液重复8次。收集的心肌细胞悬液进行差速贴壁1 h，去除非心肌细胞。用含0.1 mmol/L BrdU的DMEM培养液调整细胞浓度至2× 106/mL接种于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱（美国Thermo公司）过夜培养，第2天更换新的培养液。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 提取心肌细胞后培养48 h观察到心肌细胞互相融合，单层贴壁，细胞发生同步搏动且搏动率达80%～85%。记录各组细胞10 s基础自主搏动次数后，随机分成4组，按照以下药物处理 6 h：空白培养基组（DMSO组）、布比卡因1 mmol/L组（Bup组）、 （Pyr1）Apelin-13 2 μmol/L组（Apl组）和布比卡因1 mmol/L+（Pyr1）Apelin-13 2 μmol/L组（BAp组）。药物剂量及处理时间参考本团队先前研究[14]。

1.2.2 乳鼠心肌细胞搏动次数 通过显微镜计数视野下10 s心肌细胞自主搏动次数。药物处理完毕后时间记为T0，更换全新普通培养液，去除药物后 1、2、4、8、12 h分别记为T1、T2、T4、T8、T12，记录以上各时间点细胞搏动次数，计算细胞各时间点搏动次数与基础搏动次数的比值。

1.2.3 电镜下观察乳鼠心肌细胞线粒体形态 T12时弃去培养液，胰酶消化收集细胞，低速离心细胞成团，加入2.5%戊二醛固定细胞团，4 ℃过夜。第2天细胞团再用1%锇酸固定1 h，1%醋酸铀块染2 h。通过乙醇梯度脱水10 min，纯丙酮深度脱水10 min， 包埋液与丙酮1:1混合37 ℃烘箱2 h，包埋液与丙酮4:1 混合37 ℃烘箱过夜。加入纯包埋液，45 ℃烘箱3 h，65 ℃烘箱48 h。干燥后制成半薄切片和超薄切片，经醋酸铀-枸橼酸铅复染后在透射电镜（日本HITACHI公司）下观察其线粒体形态。

1.2.4 细胞培养液LDH含量 T12时收集各组培养液，低速低温离心，留取上清液待测。根据试剂盒说明书采用比色法检测上清液中LDH含量。最后组间数据比较时，以DMSO组为对照组，计算其他组与DMSO组的相对值。

1.2.5 心肌细胞中Apelin-13蛋白测定 T12时各组细胞低速低温离心，弃去上清液，收集下层细胞团待测。根据大鼠Apelin-13酶联免疫试剂盒说明书采用双抗体夹心原理检测心肌细胞中Apelin-13蛋白。最后组间数据比较时，以DMSO组为对照组，计算其他组与DMSO组的相对值。

1.2.6 Western blot检测心肌细胞APJ和PI3K/Akt通路蛋白的相对表达量 T12时弃去培养液，加入预冷PBS清洗，用含1% PMSF的培养细胞总蛋白提取剂提取蛋白，BCA法测定浓度并配置上样蛋白。配制SDS-PAGE 10%分离胶，5%浓缩胶电泳，采用湿法转膜将蛋白转印至PVDF膜。裁剪膜所需条带，用含5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭1 h，加入兔抗GAPDH（1:1 000）、兔抗APJ（1:500）、兔抗PI3K（1:1 000）、兔抗p-PI3K（1:1 000）、兔抗Akt（1:1 000）和兔抗p-Akt（1:1 000）、一抗液浸没相应条带于4 ℃水平摇床过夜，次日加入山羊抗兔IgG（H+L）HRP（1:5 000）室温孵育1 h，后加入ECL发光液，用凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）自动显影读取条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值。最后组间数据比较时，以DMSO组为对照组，计算其他组与DMSO组的相对值。

1.3 统计学处理方法

2 结果

2.1 4组乳鼠心肌细胞自主搏动变化

与DMSO组比：aP ＜0.05；与Bup组比：bP ＜0.05；与Apl组比：cP ＜0.05。图1 4组乳鼠心肌细胞自主搏动变化

单纯布比卡因处理后，T0时全部心肌细胞停止搏动，布比卡因诱导心肌细胞停搏模型制备成功。各组间细胞自主搏动次数差异有统计学意义（P＜0.001）。与DMSO组比，Bup组搏动次数全程减少；Apl组搏动次数在T0、T1明显增加；BAp组搏动次数在T0、T1、T2明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与Bup组比，Apl组搏动次数全程增加；BAp组搏动次数在T0、T1、T2明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与Apl组比，BAp组搏动次数在T0、T1、T2、T4明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 4组乳鼠心肌细胞电镜下线粒体形态

DMSO组及Apl组线粒体呈圆形或卵圆形，结构完整，嵴呈板层状，排列整齐、致密；Bup组线粒体明显肿胀，结构破坏空泡化，嵴移向周围，变短溶解；BAp组线粒体较Bup组结构明显改善，嵴变致密，空泡减少。见图2。

图2 4组乳鼠心肌细胞电镜下线粒体形态

2.3 4组细胞培养液LDH含量比较

与DMSO组比，Bup组和BAp组的细胞培养液LDH含量均明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Bup组比，Apl组和BAp组细胞培养液LDH含量均明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Apl组比，BAp组细胞培养液LDH含量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 4组乳鼠心肌细胞培养液LDH含量变化

2.4 4组乳鼠心肌细胞Apelin/APJ表达

与DMSO组比较，Bup组心肌细胞Apelin-13及APJ蛋白表达均明显下调，Apl组心肌细胞Apelin-13及APJ蛋白表达均明显上调，BAp组心肌细胞Apelin-13 蛋白表达明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与Bup组比，Apl组和BAp组心肌细胞Apelin-13及APJ蛋白表达均明显上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与Apl组比，BAp组心肌细胞Apelin-13及APJ蛋白表达均明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 4组乳鼠心肌细胞Apelin/APJ表达

2.5 4组乳鼠心肌细胞PI3K/Akt通路蛋白表达

与DMSO组比较，Bup组心肌细胞p-PI3K和p-Akt蛋白表达均明显下调，Apl组心肌细胞p-Akt蛋白表达明显上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与Bup组比，Apl组和BAp组心肌细胞p-PI3K和p-Akt蛋白表达均明显上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与Apl组比，BAp组心肌细胞p-PI3K和p-Akt蛋白表达均明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。4组心肌细胞PI3K和Akt总蛋白表达均差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图5 4组乳鼠心肌细胞PI3K/Akt通路蛋白表达

3 讨论

对于布比卡因所致的循环虚脱甚至心脏停搏这种危急情况，寻求安全有效的抢救药具有极其重要的临床价值。Apelin作为一种多肽类物质，翻译修饰过程中切割成不同活性片段，如Apelin-36、 Apelin-17和Apelin-13等，而（Pyr1）Apelin-13是焦谷氨酰胺形式的Apelin-13，因其较高的抗降解性、稳定的生物活性而被广泛用于体内外研究中[4，15]。 乳鼠心肌细胞是一种具有自发性节律搏动的心肌细胞。LDH作为催化乳酸和丙酮相互转化的同工酶，稳定存在于动物组织中，而在心脏组织中活性较高。当心肌细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外，故检测细胞培养液中LDH含量可判断细胞受损程度。本研究制备布比卡因诱导的乳鼠心肌细胞停搏模型，给予（Pyr1）Apelin-13处理，结果表明（Pyr1）Apelin-13 可以加快心肌细胞搏动的恢复，明显改善布比卡因所致的线粒体损伤，显著减少培养液中LDH含量。这结果与本团队先前在在体大鼠[13]实验中报道的相符合。这提示（Pyr1）Apelin-13可以逆转布比卡因心肌毒性，具有潜在的临床应用价值，给治疗布比卡因心肌毒性提供了新的思路。

布比卡因通过抑制离子通道功能[16]、抑制能量代谢[17]和加剧氧化应激[18]等方面作用于心肌细胞从而产生心肌毒性。近年来研究报道Apelin不仅可加快心脏的传导[9]、增强离子通道电流[15，19]、增强心肌收缩力[5]，还能改善心肌细胞能量代谢[11]、 减轻心肌细胞氧化应激[7]，这些表现都与布比卡因心肌毒性的机制相拮抗。本研究结果显示：与DMSO组比较，Bup组心肌细胞Apelin-13及APJ蛋白表达显著下降；而BAp组Apelin-13及APJ蛋白表达较Bup组明显上调。这提示布比卡因可抑制内源性 Apelin/APJ蛋白表达，而外源性（Pyr1）Apelin-13可启动心肌细胞Apelin/APJ系统，改善布比卡因对其的抑制作用。

PI3K是一种磷脂酰肌醇激酶，由调节亚基p85和催化亚基p110构成，被认为是最重要的调节蛋白之一。而Akt是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激 酶，是PI3K的主要下游分子。PI3K/Akt通路在心肌细胞功能、大小和存活的调控中起核心作用[20]。越来越多的研究表明Apelin/APJ系统通过激活PI3K/Akt通路发挥心脏保护作用。LI等[8]报道在小鼠急性心肌梗死模型中，外源性Apelin预处理可减轻小鼠急性缺血性心律失常发生，而联用PI3K抑制剂LY294002处理后，可消除Apelin的心肌保护作 用。另有研究报道体内Apelin过表达的大鼠在糖尿病心肌缺血再灌注损伤中可通过激活PI3K通路改善心功能、减少心肌损伤面积、减少心肌细胞凋亡及氧化应激[7]。在H9C2心肌细胞研究中，Apelin-13 通过激活PI3K/Akt信号通路减轻葡萄糖剥夺诱导的心肌细胞自噬[21]和苯肾上腺素诱导的心肌细胞肥大[12]。本研究中，与DMSO组比较，Bup组抑制心肌细胞中p-PI3K及p-Akt蛋白表达；而BAp组p-PI3K及p-Akt蛋白表达较Bup组则显著上调；但各组间PI3K及Akt蛋白的表达差异无统计学意义，与YE等[14]报道相符。这提示（Pyr1）Apelin-13也许通过激活PI3K/Akt磷酸化逆转布比卡因诱导的心肌细胞停搏。外源性（Pyr1）Apelin-13可逆转布比卡因诱导的心肌细胞停搏，其机制也许与激活PI3K/Akt磷酸化有关。