基于JAK/STAT信号通路探讨PRELID1表达在胃癌恶性生物学行为中的作用

夏勇生,赵 萌,杨一群,马珍丽,桑梦倩,陈德利

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤,其病死率位居全球第4位[1]。我国是胃癌高发国家之一[2],且多数患者在就诊时已处于进展期,以手术为主的综合治疗尚不能有效提升胃癌患者的5年生存率[3]。肿瘤细胞的无限增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为是导致胃癌预后不良的重要因素[4-5]。相关进化和淋巴兴趣域蛋白1(PRELID1)在肝癌、子宫内膜癌和胶质瘤中的表达升高,其可通过增强线粒体内的物质转运参与肿瘤细胞的恶性增殖过程[6-8]。目前,PRELID1在胃癌中的表达和生物学功能尚未见相关报道。本实验利用TCGA数据库和蚌埠医学院第一附属医院诊治的111例胃癌病例联合分析PRELID1在胃癌和癌旁组织中的表达及与临床病理特征的关系,利用生物信息学技术预测PRELID1调控胃癌的分子机制,并通过体内和体外实验验证,旨在丰富对PRELID1生物学功能的认识,为改善胃癌的远期预后提供新思路[9]。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取2013年1月～2016年12月在蚌埠医学院第一附属医院行胃癌根治术的胃癌患者。纳入标准:诊断为原发性胃癌;成功行胃癌根治术。排除标准:合并其他恶性肿瘤;术后死于非胃癌因素;患者病例资料缺失。依据以上标准最终入选111例胃癌患者,采集患者相关信息:(1)临床资料:姓名、性别、年龄、术前肿瘤标志物指标如CEA、CA19-9、病理报告等;(2)生存资料:通过电话随访和门诊复查等方式采集患者术后5年生存信息。(3)胃癌组织蜡块:从蚌埠医学院第一附属医院病理科调取患者的手术标本蜡块,包括癌组织和配对癌旁正常组织。本实验获蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会审核[伦科批字(2022)第199号],患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 将手术标本蜡块连续切片后经脱蜡水化处理,再经抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭后,孵育一抗和二抗,DAB显色和苏木精复染细胞核后封固。镜下(400×)随机挑选5个不重复的视野,采用Image J软件计算目标蛋白的积分光密度值(integrated optical density, IOD),并以癌旁IOD值为基准,计算癌组织和癌旁组织的相对IOD值。一抗PRELID1(稀释比1 ∶200)购自Proteintech公司,Ki67(稀释比1 ∶200)购自Abcam公司。

1.2.2生物信息学分析 GEPIA数据库分析PRELID1在多种恶性肿瘤的表达情况。UALCAN数据库分析PRELID1在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达差异及其与临床特征的关系。Kaplan-Meier Plotter数据库分析PRELID1的表达对预后的影响。由UCSC XENA下载STAD的HTSeq-Counts格式的文件并进行log2转化,在基迪奥生物信息云平台画出满足∣log2(FC)>2∣且P<0.05的DEGs火山图,以P值为筛选条件选取前20的基因做KEGG分析,再将差异基因进行GSEA分析,预测PRELID1调控胃癌的途径和机制。

1.2.3慢病毒转染实验 MGC803购自国家生物医学实验细胞资源库,采用RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)培养。利用慢病毒(上海吉凯基因公司)转染调控MGC803细胞中PRELID1的表达,依据其表达量的高低分为LV-PRELID1组和Si-PRELID1组,Control组为未经处理的MGC803细胞。操作简述为:将MGC803细胞铺于6孔板中,37 ℃培养6 h,分别加入感染增强液、过表达慢病毒载体和特异性干扰(siRNA:AAGACTATGAAGGGTTTT GAATA),经12 h后更换为完全培养基再培养3天,最后通过含1 μg/mL嘌呤霉素的完全培养筛选出稳定表达细胞株,采用Western blot法验证转染效果。

1.2.4CCK-8实验和Transwell实验 CCK-8实验:将MGC803细胞按3×103个/孔的密度铺于96孔板中,37 ℃培养24 h,每孔加入20 μL的CCK-8溶液(北京索莱宝科技公司),继续培养3 h,最后置于酶标仪中测定A450 nm。侵袭实验:将20 μL基质胶(美国康宁公司)加入Transwell上室,37 ℃培养4 h。用无血清培养基重悬MGC803细胞,按1×104个/孔的密度加入上室,再将800 μL完全培养基加入下室,37 ℃培养24 h。吸除下室的培养基,擦去上室的剩余细胞,4%多聚甲醛固定侵袭到下室的细胞并用0.2%结晶紫染色,置于显微镜下观察并采集照片。迁移实验:除不加基质胶外,其余同侵袭实验。

1.2.5Western blot法 利用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞或组织的总蛋白并进行定量,再依次进行SDS-PAGE电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭、孵育一抗和二抗,利用化学发光法和多功能凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)采集图片,采用Image J软件分析目标蛋白的相对表达量。一抗PRELID1购自Proteintech公司,JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3购自Abcam公司,以β-actin为内参,抗体稀释比均为1 ∶1 000。

1.2.6裸鼠皮下成瘤模型 将购自江苏集萃药康生物公司的18只雄性BALB/c-Nude裸鼠[8周龄、体重约(20±2)g]随机分为3组,每组6只,分别接种PRELID1表达量不同的3组MGC803细胞,并据此将小鼠分为LV-PRELID1组、Si-PRELID1组和Control组。操作步骤:将MGC803细胞消化、离心并重悬成密度为每毫升1×108个细胞悬液,用注射器抽取100 μL悬液接种到裸鼠的背部皮下,正常饲养14天后,麻醉状态下处死小鼠,取出瘤体,拍照并计算肿瘤体积。

2 结果

2.1 胃癌组织中PRELID1的表达GEPIA和UALCAN数据库分析发现PRELID1在胃癌组织中高表达且明显高于癌旁组织(P<0.001,图1A、B)。免疫组化检测结果显示,111例胃癌组织中PRELID1和Ki67的表达高于癌旁组织(图1C)。Spearman相关性分析显示,胃癌组织中PRELID1表达与Ki67的表达呈正相关(P<0.001,图1D)。

C胃癌组织癌旁组织

2.2 PRELID1表达与临床病理特征的关系UALCAN数据库显示PRELID1的表达量与淋巴结转移和肿瘤分期呈正相关(P<0.05,图2)。以胃癌组织中PRELID1相对IOD值的中位数为界,将本组病例分为低表达组(n=55)和高表达组(n=56)。统计分析发现,PRELID1高表达组中CEA≥5 μg/L(P=0.004)、N2+N3分期(P=0.003)的患者比例显著高于PRELID1低表达组(表1)。

表1 PRELID1表达与胃癌临床病理特征的关系[n(%)]

图2 胃癌组织中PRELID1表达量与淋巴结转移和肿瘤分期的关系:A.PRELID1表达与淋巴结转移的关系;B.PRELID1表达水平与肿瘤分期的关系;*P<0.05

2.3 PRELID1表达与胃癌患者预后的关系Kaplan-Meier Plotter数据库表明PRELID1高表达组患者的总生存期比低表达组患者短(P=0.003 9,图3A);Kaplan-Meier法分析本组111例患者的生存数据显示,PRELID1高表达组患者的5年生存率显著低于PRELID1低表达组(P<0.000 1,图3B)。

图3 PRELID1表达水平与胃癌患者预后的关系:A.Kaplan-Meier Plotter数据库分析PRELID1高表达降低胃癌患者的总生存率;B.Kaplan-Meier法分析PRELID1高表达降低胃癌患者术后5年生存率

2.4 影响胃癌根治术后5年生存率的危险因素分析单因素分析联合多因素Cox回归分析显示:PRELID1高表达、CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T3+T4分期和N2+N3分期是影响胃癌患者根治术后5年生存率的独立危险因素(P均<0.05)。ROC曲线表明PRELID1的表达对胃癌患者行根治术后的5年生存率具有一定的预判价值(P<0.001,图4,表2)。

表2 影响胃癌患者根治术后5年生存率的危险因素分析

图4 ROC曲线分析PRELID1表达对胃癌患者术后5年生存率的预判价值

2.5 生物信息学预测PRELID1的生物学功能基于TCGA-STAD数据集对胃癌样本及正常样本进行差异表达基因分析,发现PRELID1在胃癌组织中表达显著上调(P<0.05,图5A)。KEGG富集分析结果提示PRELID1在胃癌中的作用机制和JAK-STAT信号以及癌症中的转录调控异常有关(P<0.05,图5B)。GSEA富集分析结果显示DNA复制功能被上调(P<0.05,图5C)。

图5 生物信息学预测PRELID1的生物学功能:A.火山图分析PRELID1在胃癌组织中的表达水平;B.KEGG富集分析PRELID1在胃癌中的作用机制;C.PRELID1在胃癌组织中的GSEA富集分析

2.6 PRELID1体外通过JAK/STAT信号对胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响慢病毒成功调控MGC803细胞中PRELID1的表达量(P<0.05,图6A、B)。CCK-8结果显示,与Control组相比,Si-PRELID1组胃癌细胞增殖能力减弱(P=0.026),而LV-PRELID1组增殖能力则增强(P=0.016,图6C)。Transwell实验表明,LV-PRELID1组胃癌细胞的迁移(P=0.016)和侵袭(P=0.025)能力较Control组增强,而Si-PRELID1组则迁移(P=0.048)和侵袭(P=0.029)能力降低(图6D)。Western blot实验发现,与Control组相比,p-JAK(P<0.001)和p-STAT(P=0.002)蛋白在LV-PRELID1组中表达升高,在Si-PRELID1组中p-JAK(P=0.044)和p-STAT(P=0.048)蛋白表达则降低(图6E、F)。

图6 PRELID1体外通过JAK/STAT信号对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响:A、B.慢病毒调控MGC803细胞中PRELID1的表达;C.PRELID1表达对胃癌细胞增殖的影响;D.Transwell实验检测PRELID1表达对胃癌细胞迁移和侵袭的影响;E、F.Western blot实验检测PRELID1表达对胃癌细胞中JAK/STAT信号的影响;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.7 PRELID1体内通过JAK/STAT信号对胃癌细胞增殖的影响裸鼠皮下成瘤实验显示,LV-PRELID1组裸鼠的肿瘤组织体积值高于Control组(P=0.047,图7A、B),而Si-PRELID1组则低于Control组(P=0.005,图7A、B)。Western blot法检测结果发现:与Control组相比,LV-PRELID1组中p-JAK(P<0.001)和p-STAT(P<0.001)蛋白的表达被促进,Si-PRELID1组中p-JAK(P=0.021)和p-STAT(P=0.017)蛋白表达被抑制(图7C、D)。

图7 体内实验检测PRELID1通过JAK/STAT信号对胃癌细胞增殖的影响:A、B.裸鼠皮下成瘤体积;C、D.Western blot法检测PRELID1表达对胃癌组织中JAK/STAT信号的影响;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 讨论

胃癌细胞的恶性增殖和侵袭导致了肿瘤的生长和转移,从而加剧了胃癌的恶化[10-11]。近年来,针对抑制癌细胞恶性增殖的研究,已受到大量学者的重视。本实验联合在线癌症数据库和蚌埠医学院第一附属医院存档的胃癌患者临床数据,发现PRELID1在胃癌中的表达升高且与较差的生存率有关,细胞学实验和动物实验结果表明,PRELID1可能通过上调JAK/STAT信号促进胃癌细胞的恶性增殖、迁移和侵袭。

新近研究显示:PRELID1编码的蛋白质定位于线粒体膜间隙,其可通过调控心磷脂的合成影响氧化磷酸化进程、线粒体分裂、线粒体活性氧的产生等一系列线粒体驱动功能[12]。此外,PRELID1亦可通过调控线粒体的生物学功能参与肿瘤细胞的恶性增殖过程[13],且PRELID在肝癌、子宫内膜癌和胶质瘤中的表达升高,并与患者的生存期缩短有关[6-8]。本实验利用GEPIA和UALCAN数据库分析发现PRELID1在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织,并通过本实验的临床病例得到验证。通过分析PRELID1表达与临床病理特征的关系发现:PRELID1高表达、CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T3+T4分期和N2+N3分期是影响胃癌患者根治术后5年生存率的独立危险因素,且PRELID1的表达对患者根治术后5年生存率具有一定的预判价值。目前,PRELID1调控胃癌的作用途径并不明确。

回顾文献发现,PRELID1在癌细胞增殖过程中发挥关键作用,参与肿瘤细胞生长和凋亡的调控,被认为是癌症预后不良的标志[12-13]。作者基于TCGA数据分析并获得PRELID1高、低表达组的差异基因,并进行基因富集分析。GSEA结果显示DNA复制和细胞增殖的相关生物学过程被促进,且KEGG富集分析结果表明,PRELID1调控胃癌可能与癌症中的转录调控异常有关,作者进一步开展体外和体内实验进行验证。首先,体外实验利用慢病毒调控胃癌细胞中PRELID1的表达水平,并通过CCK-8和Transwell实验发现PRELID1促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭;其次,通过体内实验构建裸鼠皮下成瘤模型发现PRELID1促进肿瘤生长。KEGG富集分析结果提示PRELID1可能通过JAK/STAT信号促进胃癌细胞的恶性生物学行为。JAK/STAT途径作为多种细胞因子和生长因子的主要信号传导机制,促进肿瘤细胞发生增殖和迁移[14-16]。Western blot实验检测结果发现,胃癌细胞和肿瘤组织中PRELID1表达可促进JAK/STAT信号蛋白的表达。因此,PRELID1可能通过上调JAK/STAT信号促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭的恶性生物学行为。

本实验首先通过对UALCAN和Kaplan-Meier-plotter等数据库和蚌埠医学院第一附属医院的临床病例进行深入分析:首先,PRELID1在胃癌组织中的表达异常升高且与临床预后不良有关,丰富了PRELID1生物学功能的认识,也为改善胃癌患者预后提供了新视角[17-18];其次,本实验通过细胞学研究和动物实验验证PRELID1通过上调JAK/STAT信号调控胃癌细胞的恶性生物学行为,对于PRELID1调控胃癌的分子机制的深入研究有望为胃癌治疗策略的革新提供更多可能[19]。本实验尚存在一定的局限性:单中心的研究样本数量有限,有待扩大样本量以明确结果的可靠性;本实验只验证了PRELID1通过JAK/STAT信号调控胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,可能忽略了PRELID1作用于胃癌的其他途径和分子机制。

综上,本实验发现PRELID1在胃癌组织中表达升高,其可能通过激活JAK/STAT信号促进胃癌细胞的恶性生物学行为。