脾虚湿盛证动物模型构建方法探析

王若冲 吴凤芝 戴 宁 江 洋 廖文勇 张炜悦 李 峰

(北京中医药大学,北京,102488)

脾虚湿盛证,又称脾虚湿困证、脾虚湿滞证,因饮食不节、劳倦过度或思虑过度,或年老体弱,久病虚损导致脾胃虚弱,运化水湿功能失常;亦可由久居湿地、涉水淋雨等外湿因素引起,临床以脘腹痞胀或痛,泛恶欲吐,食少、纳呆,头身困重,倦怠乏力,肢体浮肿,大便糖稀或泄泻,小便短少,可伴见水肿,腹水等为症状[1-2]。现代研究表明,脾虚湿盛证是肥胖症[3]、支气管扩张[4]、腹泻型肠易激综合征[5]、溃疡性结肠炎[6]等多种疾病的主要证型,严重影响人们的生命质量;2020年颁布的《疲劳性亚健康的判定及中医证候辨识》中指出脾虚湿困证是疲劳型亚健康中医基本证型之一[7]。为了深入探讨脾虚湿盛证的本质及探寻有效的治疗与干预方法,诸多研究者从不同角度构建了脾虚湿盛证动物模型。但与脾虚不同,脾虚湿盛的病因、病机更复杂,导致动物模型的建立也更为复杂。20世纪末,开始出现相关动物模型的文献报道[8-9],近十年来研究逐步深入、成果逐渐丰富,脾虚湿盛证动物模型的构建已成为现代中医脾胃病研究与中医证候研究的热点,但目前来看仍不够完善并存在一些不足。本文对脾虚湿盛证造模思路与方法、脾虚湿盛证动物模型评价指标进行梳理、总结与探讨,并对现有问题进行剖析、对研究发展方向进行展望,以期推动其发展。

1 脾虚湿盛证造模思路与方法

《素问·至真要大论篇》曰:“诸湿肿满,皆属于脾。”言明脾之运化失司是“湿”产生的关键,但湿为阴邪,易损伤阳气,湿邪困脾则又会影响脾胃的功能,二者可互为因果、相互作用导致脾虚湿盛证的形成。目前脾虚湿盛证的动物模型即以病因作为切入点与思路构建模型,主要以饮食失宜、劳逸失度、久居湿地等作为造模因素。

1.1 单因素法

1.1.1 饮食失宜法 中医认为,过食肥甘厚味会导致中焦壅遏,脾运失常,湿浊内生[1],饮食失宜的单因素法中主要通过对啮齿类动物进行高脂饲料喂养,常应用于脾虚湿盛肥胖症的模型建立。如陈兰玉等[10]对雄性小鼠连续10周高脂饲料喂养建立脾虚湿阻盛证肥胖小鼠模型,发现模型组小鼠体质量及粪便含水量明显增高、转棒仪实验中表现出明显疲劳症状。

1.1.2 久居湿地法 久居湿地法是通过将实验动物长期放置于高湿度环境从而构建模型的一种方法,如王昕等[11]将大鼠放于相对湿度90%～100%的自制造模箱内,每天14 h共持续45 d,成功建立湿伤脾阳证大鼠模型。张六通等[12]延长了造模时间,将大鼠每天放置于底部有2 cm的厚湿锯末的自制造模箱内12 h(相对达湿度(90±5)%),造模持续108 d。实验结束后发现,模型组大鼠胃泌素含量下降,胃动素增加,免疫力下降,肠道菌群失衡,且大鼠宏观体征符合脾虚湿盛证的表现。李蓉[13]将小鼠放置于4 ℃低温高湿度的环境下连续7 d,每天4 h,发现小鼠不仅出现脾虚症状,如毛发暗淡无光泽且稀疏、体质量减少等;还出现湿盛的症状,如足背皮肤浮肿,大便糖稀等,并认为此方法很好地模拟了外感寒湿损伤脾阳的过程与表现。

1.2 复合双因素法

1.2.1 饮食失宜法联合久居湿地法 郭金龙和颜正华[9]于1988年首先采用肥甘厚味饮食法联合久居湿地法构建大鼠脾虚湿盛证模型,将大鼠连续5 d饲养于相对湿度(95±3)%的环境中,并每天给予大鼠含有20%的蜂蜜饮品50 mL,在造模开始及结束后的第48、96 h给予大鼠猪油灌胃20 g/只,造模结束后,造模动物出现了不欲饮水,食欲不振,倦怠便溏、体质量降低,体温升高等表现。王剑和赵若龙[14]每天8:00-12:00时及14:00-18:00时将小鼠置于湿度(90±5)%的人工箱内,并且每天给予小鼠灌胃熟地黄混合液(熟地黄、牡蛎、啤酒、花生油制备)0.5 mL/只,造模共持续6 d,发现小鼠出现湿困脾胃证的表现,经藿香正气液治疗后基本恢复正常水平。朱梦梦等[15]首先采用高脂饲料喂养小鼠3周,于第4周将垫料加水营造外湿环境(50 g/100 mL),累计造模10周,将脾虚湿阻证的一般状态总结为模型筛选表,并配合粪便含水量以及疲劳转棒仪实验对造模小鼠进行筛选,最终发现脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠造模成功率高于80%。

1.2.2 饮食失宜法联合劳倦过度法 高洁等[16]为探讨脾虚水湿不化大鼠模型的胃肠功能,在每天高脂低蛋白饲料喂养的基础上,以负重力竭游泳作为过劳因素,连续造模60 d,建立大鼠脾虚水湿不化模型。模型组大鼠血清淀粉酶含量、胃泌素含量及尿中D-木糖的排泄率均显著降低,表明脾虚水湿不化状态下大鼠胃肠功能会出现下降。赵文晓等[17]及杨彬彬等[18]也以高脂低蛋白饲养联合负重力竭游泳的方法,分别对大鼠进行连续48 d及56 d的实验后成功构建了大鼠脾虚湿困证模型。

此外也有学者在肥甘厚味的基础上增加了饥饱无度及过食寒凉的造模因素构建动物模型。如刘金莲等[19]单日以高脂饲料喂养大鼠,双日对大鼠禁食,并且每天对大鼠进行力竭游泳训练,共持续28 d。发现大鼠具备脾虚湿盛证的一般表现与宏观体征,并以胃泌素、胃动素等作为脾虚相关指标,白蛋白、醛固酮等作为湿盛指标,对模型进行了系统评价。陈浩等[20]首先在高脂饲料喂养的基础上,对大鼠进行2次/d,2 mL/(次·只)的冰糖水灌胃,同时每天对大鼠进行力竭游泳训练。造模后检测大鼠脾虚湿盛相关指标,并以肝肾功能的多项指标作为排除肝郁气滞、脾肾两虚等证型的依据,确定此方法建立了脾虚湿阻证肥胖动物模型。

1.3 复合多因素法 复合多因素法常选用饮食失宜法、劳倦过度法及久居湿地法等中的3～4个造模因素进行模型构建,如刘瑶等[21]建立湿困脾胃证亚健康大鼠模型,将模型组大鼠饲养于湿度(90±5)%的实验室内,并且每天将大鼠放置于4 cm深的水笼中8 h,饮食为单日禁食,双日喂养高脂饲料;并于造模的第1天、第4天、第7天强迫大鼠高强度游泳,当大鼠头沉入水面后短暂拿出休息,然后再次放入水中,连续5次后结束游泳,共计造模10 d。发现模型组大鼠与健康大鼠相比出现饮水量下降,大便糖稀,皮毛浑浊,活动能力下降,精神萎靡,体质量减轻等症状,通过生化指标检测发现模型组大鼠的免疫及代谢功能下降,并采用藿香正气散进行药物反证。孙冬月和高慧[22]使用中间带有隔板的水笼,使大鼠站立于隔板之上,隔板下水深3 cm,模拟外湿环境;同时每天强迫大鼠进行20 min的游泳;饮食方面单日正常饮食猪油灌胃,双日禁食冰水灌胃。通过宏观体征观察、胃肠功能检测及能量代谢等指标检验模型。

此外,在脾虚湿盛证动物模型构建中,改良多平台水环境法与水笼法,可作为一种复合因素进行造模。改良多平台水环境法是将啮齿类动物放入一个特制水箱的小平台上,平台下1 cm由水注满,强迫实验动物在平台上站立[23]。水笼法是将大鼠放置于2～4 cm水深的笼内饲养[24],此2种方法利用啮齿类动物天生畏水习性,当其休息或入睡时即会落入水中惊醒,从而一直保持站立状态。改良多平台水环境法及水笼法不仅可以模拟外湿侵袭的因素,还可模拟久立劳倦的因素。2008年张丰华等[25]首次应用此方法将大鼠放置于4 cm深的水笼中,每天强迫其站立8 h,配合饥饱无度法(单日禁食灌胃4 ℃冰水,双日大鼠正常饮食灌胃猪油),连续造模20 d,建立湿困脾胃证大鼠模型,此外张丰华根据文献调研与大鼠生物学特征,制定了脾虚湿困证模型宏观症状诊断标准,此后研究者多以此为标准评价动物模型。熊艳玲等[26]复制此方法进行模型构建,将原本的20 d实验时长延长到了48 d,并通过改进的脾虚湿困证宏观标准、脾虚湿困证动物模型症状积分评分标准评价模型建立。此外,亦有研究调整饮食失宜因素,如单日猪油灌胃[27],双日禁食(但不灌冰水)与水笼法相配合,但方法大同小异此处不再赘述。

改良多平台水环境法多应用于脾气虚证的模型构建,近年来也有部分研究从理论方面讨论了改良多平台水环境法联合饮食失宜等因素建立脾虚湿盛证动物模型的可能性[28-29]。孟高达[30]建立脾虚湿阻型功能性腹泻大鼠模型,给予大鼠高乳糖饲料喂养,并采用改良多平台水环境法对大鼠进行每天进行10 h的强迫站立,造模时间为两周,发现模型组大鼠出现明显消瘦、便溏、自主活动减少等脾虚湿阻证症状,血清中D-木糖含量远低于空白组,小肠吸收率下降,并以参苓白术散作为药物反证取得良好疗效,认为采用高乳糖喂养联合改良多平台水环境法可建立功能性腹泻脾虚湿证的大鼠模型。

2 脾虚湿盛证动物模型评价指标

模型的评价标准是模型构建中至关重要的一部分,动物模型是否可以良好地模拟出临床疾病及相关证型,需要客观、准确及科学的评价标准。目前,脾虚湿盛证动物模型主要从动物模型似人的症状表现;借助先进技术检验的客观指标2个方面进行模型评价。

2.1 动物模型症状及表征评价 临床中辨证是证型诊断的基础,动物模型中“辨证”则需要将人体症候表现与模型动物的生物学特性相联系,制定诊断标准。张丰华等[25]根据《中医证候规范》《中医证候病理学》《中医湿病学》等书籍并结合大鼠生物学特征,从模型形成的时间及自然恢复速度、生活状态、食量等8个方面制定了湿困脾胃证大鼠模型的宏观症状诊断标准。此后李姿慧等[31]、熊艳玲等[26]也分别根据文献及大鼠生物学特性制定了脾虚湿困证大鼠模型宏观体征诊断标准。目前研究者评价脾虚湿盛证模型大鼠的宏观体征多选用以上3种评价标准。见表1。此外,熊艳玲等[26]还根据大便、饮食、体质量增长率、倦怠表现及皮毛状态分为5个评分模块,每个模块根据动物的相应状态以0～4分进行量化评价,建立了大鼠脾虚湿困模型症状量化积分表。当总积分≥4分,可视为模型建立成功;当4≤总积分≤5视为轻度,6≤总积分≤10分为中度,>10分为重度。见表2。

表1 大鼠脾虚湿困证模型宏观症状常用评价标准

表2 脾虚湿困大鼠模型症状量化积分

2.2 客观评价指标

2.2.1 疲劳相关指标 脾虚会表现出神疲乏力、少气懒言、肢体倦怠等症状;湿邪重浊黏滞,可阻碍气机运行,留滞肢体经络,导致肢体沉重、倦怠乏力等疲劳表现。因此脾虚湿盛证中疲劳是一个重要的评价因素。行为学实验中可通过转棒仪疲劳实验、负重力竭游泳实验及抓握力实验等进行评价,生化指标中ATP、乳酸、乳酸脱氢酶、尿素氮及磷酸肌酸激酶等均是判断脾虚湿盛证模型疲劳状态的重要指标。研究表明,脾虚湿困证模型组大鼠血清乳酸、乳酸脱氢酶、尿素氮下降,负重力竭游泳时间减少[32-33]。此外有研究者从能量代谢方面进行研究,发现脾虚湿盛证大鼠血糖与钠钾泵(Na+-K+-ATP酶)、钙泵(Ca2+-ATP酶)会出现下降[30,34]。

2.2.2 胃肠功能指标 脾虚湿盛可导致脾胃运化失司,消化系统功能下降,因此胃肠功能衰退和(或)损伤是脾虚湿盛证评价的重要指标之一,多体现于胃肠动力功能下降与胃肠黏膜损伤。胃排空率、小肠推进率,胃动素是判断胃肠道运动功能的重要指标[35],如刘瑶和刘伟[36]通过水笼法联合劳倦过度法、饮食失宜法建立亚健康脾虚湿困模型,发现大鼠胃残留率升高,小肠推进率减少,经灌服藿香正气散干预后明显改善。孙冬月等[22]建立湿困脾胃证大鼠模型后发现与空白组相比,大鼠胃排空率,肠推进率减少;并通过病理切片,发现模型组胃黏膜充血严重,出现肿胀及脱落,胃底腺肿胀,黏膜肌增生,形态与结构上均有改变。王剑和赵若龙[14]对湿困脾胃证小鼠进行胃肠组织病理观察,发现胃胀气明显,胃黏膜表面液体明显增多,经染色后在显微镜下观察,发现肠道组织黏液分泌增多,黏膜层存在充血水肿。

此外,血清胃泌素与D-木糖的浓度是判断脾虚证或脾虚湿盛证胃肠道功能的“金标准”[37-38],胃泌素可作用于消化系统平滑肌上的受体,产生三磷酸肌醇,从而激发胃平滑肌收缩行为,另外胃泌素是主要调剂胃酸分泌的激素。D-木糖是一种在血液中不含有的五碳糖,口服D-木糖后血液和尿液中的浓度可反应小肠吸收功能,同时胃泌素的分泌可促进D-木糖吸收。因此,胃泌素及D-木糖浓度是评价脾气虚或脾虚湿盛证的严重程度及干预后疗效的重要指标。杨彬彬等[19]通过饮食失宜法联合劳倦过度法建立脾虚湿困证大鼠模型,检测后发现血清中胃泌素、D-木糖、胃动素浓度下降明显,经过黄芪多糖干预后可明显改善。

2.2.3 水液代谢异常相关指标 脾虚湿盛证的另一大表现是水液代谢失常,这是脾虚湿盛证与单纯脾虚证相鉴别的重要指标。研究者可通过粪便含水量及肠管含水量的测定进行鉴别,亦可通过水通道蛋白中白蛋白、醛固酮、血管活性肠肽等含量进行评判。白蛋白是血浆中含量最多的蛋白质,具有维持血液胶体渗透压的功效,是判断水液代谢及水肿状态的一个重要的指标[39]。此外醛固酮、血管活性肠肽是参与水液代谢的重要激素,也与人体水液代谢相关,血管活性肠肽与其受体结合后,可刺激结肠黏膜,增加水和电解质的分泌而导致腹泻。因此,有学者认为该指标可在一定程度上反映脾虚湿盛证大便溏稀的微观变化[40]。如,王彦芳等[41]检测脾虚水湿不化模型发现血清中的白蛋白、血管活性肠肽含量明显升高,提示机体出现水液代谢紊乱,湿邪偏盛。

3 研究的不足

近年来对于脾虚湿盛证动物模型构建方面的研究取得了一定进展,但是仍存在一些问题与不足之处。

3.1 动物模型证型命名 以脾为病位湿为病性的证型文献中记载较多,命名又较为相近,十分繁琐,给研究者带来了诸多不便。1)根据国家技术监督局颁布的国家标准GB/T 16751.2-2021《中医临床诊疗术语·证候部分》[1]将脾为病位、湿为病性的证候分为6种证型(不以寒热病性为主),可见表3,部分证候如脾虚湿盛证又有多种同义命名,而这6类证型临床表现又较为相同。在临床中此6类证型的病机及表现即有较高的重合,辨证存在难度,故在动物模型中的辨证则更加困难,这就导致动物模型构建中此6类证型的造模思路相同,方法相近,评判标准较为一致,但其动物模型证型命名却十分混乱,如参与措施运用水笼法联合饮食不节法(干预方法与持续天数均相同),但模型却有湿困脾胃证、脾虚湿盛证、脾虚湿阻证等多种证候命名。2)此外,研究者在动物模型命名时未以标准化证型命名,如脾虚水湿不化模型、湿伤脾阳证及湿滞脾胃模型等。这些命名较为口语化,未使用证候标准化用语,使原本就多样的证候命名更加繁杂,也给研究者带来很多困难。

表3 脾为病位湿为病性之证型标准

3.2 模型证候评价标准 合理的证候模型需要科学的评价体系,但现阶段脾虚湿盛证动物模型的评价体系仍然存在一些问题:1)虽然脾虚湿盛证动物模型症状及表征的评价经总结与量化,已形成较好的评判体系及量化标准,但如倦怠、懒动、蜷缩聚堆,毛色枯槁等的评价仍较为主观。2)脾虚湿盛证的客观指标主要集中在疲劳状态、胃肠功能、代谢功能等方面,这些指标与脾虚证的指标重合度较高。虽然目前已经发展出了一些湿盛相关的指标,但仍有不足,缺乏与“湿”相关的“金标准”。3)以方验证是证候模型评价的一个重要方法,以方药治疗效果为依据具有良好的客观性。但动物模型证型命名的混乱,造成方药选择的困难,上述研究选用方药既有单味药又有复方,各方思路互不一致,标准不统一。

3.3 构建模型的方法 近年来,脾虚湿盛证模型构建已从单因素法造模逐步转变为以饮食失宜法为核心的复合型造模法。这从病因角度更贴合当代人产生脾虚湿盛证的过程,但在具体的方法上仍存在一些不足:1)现在较主流的饮食失宜法是对啮齿类动物进行单日禁食冰水灌胃、双日正常饮食猪油灌胃的饥饱无度法[42-43],但再加上每天药物灌胃治疗,这就会导致实验动物一日之内被多次灌胃,造成食管及咽喉部的损伤,这些与实验无关的因素则会或多或少地影响实验结果。2)造模因素的表述错误,这主要出现在水笼法及改良多平台水环境法中的造模。因在此类方法中实验动物需保持站立,而无法休息或者入睡,因此部分研究者将此因素定义为睡眠剥夺。但啮齿类动物每天的睡眠时间为12～13 h[44-45],脾虚湿盛证造模中的水笼法和改良多平台水环境法站立的时间通常控制在8～10 h,远远无法达到睡眠剥夺的要求。因此,这种复合造模方法主要是通过外湿侵袭、久立劳倦的因素进行模型构建而并非睡眠剥夺。3)脾虚湿盛证模型的形成应该是一个长时间、慢性的过程,因此造模时间不应太短,实验时间在2周以上才可较好地模拟临床上发病的过程。但部分实验造模周期较短,这则与临床病史不太相符合[46]。

4 未来的展望

上述问题是研究的难点,更应是解决与发展的重点,今后可从以下几方面进行改进及发展:1)将传统较为复杂的证型,根据实验动物的生物学特性进行标准化、规范化的简化,并减少一些非标准化的证型命名使用,如可在动物模型建立中将脾虚湿盛证、脾虚水泛证等相近病因、病机及症状的证型规范为一种具有概括性的证型。2)完善证候评价体现,将主观的证候表现客观化,如便溏的程度,就可以通过粪便含水量来评判;神疲乏力的程度也可通过动物行为学中疲劳的实验或自主活动的指标进行客观评价;皮毛色泽,舌象等也可与现代科技结合,运用比色及图像分析等技术进行分析。3)完善模型构建方法,如单日禁食冰水灌胃,双日正常饮食猪油灌胃会导致无关因素影响实验,研究人员可以改为单日禁食不禁水提供冰水饮用,双日高脂饲料饲养,这样就会减少对实验动物的非必要损伤。

利益冲突声明:无。