蟾毒灵抑制M2型巨噬细胞介导的结直肠癌迁移和上皮间质转化

唐东豪,陈进宝,贾琳琳,沈东晓,尚 靖,冯月娇,卢佳豪,肖增友,何钰洁,王 杰

结直肠癌 (colorectal cancer, CRC)是世界第三大常见的恶性肿瘤,大多数结直肠癌患者的死亡是由于肿瘤转移至肝脏。全球范围内,每年诊断出约 140 万例新增结直肠癌病例,约 25% 的患者在诊断时出现肝转移[1]。 控制结直肠癌转移对于改善预后至关重要。很多报道[2]表明肿瘤细胞与肿瘤微环境的相互作用是结直肠癌转移的重要因素。巨噬细胞作为肿瘤微环境的主要成分,其中M2型巨噬细胞高表达细胞因子白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)、转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)等,通常以促进肿瘤的发展为导向[3]。IL-6是一种重要的促炎细胞因子,高表达的 IL-6 与 CRC 的不良预后相关[4]。有研究[5]表明M2型巨噬细胞释放IL-6可以促进肿瘤的发生发展。越来越多研究[6]表明蛋白激酶B (threonine-specific protein kinase, AKT)/ 磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphoinositide 3-Kinase, PI3K)是肿瘤发生上皮间质转化、促进肿瘤转移的重要因素之一。但关于M2型肿瘤相关巨噬细胞来源的IL-6对于AKT/PI3K信号通路的激活报道还比较少[7]。蟾毒灵(bufalin,BU)是临床用药华蟾素的主要活性成分,有促肿瘤细胞凋亡,抗血管生成,抑制转移的作用[8]。该文旨在研究BU对于M2型巨噬细胞介导结直肠癌转移的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株人急性白血病单核细胞THP-1、结直肠癌HCT116细胞株,从中国科学院上海细胞生物学研究所购买。

1.2 试剂及耗材RPMI1640培养基、双抗、胰酶(Trypsin-EDTA)、胎牛血清购自美国Gibco公司;佛波酯(美国SIGMA公司);ELISA 试剂盒(BOSTER,武汉);蟾毒灵购自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.3 细胞培养结直肠癌HCT116细胞、人急性白血病单核细胞THP-1均含有1%青霉素/链霉素双抗溶液、10%胎牛血清的RPMI1640培养液,置于细胞培养箱中进行恒温培养(37 ℃、5% CO2)。取生长状态良好(对数生长期)的细胞进行后续实验。

1.4 条件培养基(condition medium, CM)收集取对数生长期的THP-1细胞铺板于6 孔板,每孔种植1×106个细胞,加入IL- 4 和 IL-13。待分化为M2型巨噬细胞后弃去培养基,无血清培养基添加2 ml/孔, 48 h后收取上清液,离心800 r/min,10 min,获得CM。

1.5 荧光定量PCR实验提取细胞RNA根据艾科瑞生物试剂盒说明书去操作,逆转录按照试剂盒的说明书。PCR反应组分：2×SYBR 5 μl Template 1μl,Primer F 0.2 μl, Primer R 0.2 μl RNase free water 3.6 μl;参照仪器操作手册设置反应条件。见表1。

表1 PCR引物序列

1.6 CCK-8实验HCT116到对数生长期,胰酶消化,计数板计数后调整细胞浓度为105个/ml,100 μl细胞悬液加入到96孔板的每个孔中。第二天细胞贴壁后,去除培养基,根据实验需要对细胞进行不同浓度的BU或条件培养基处理,培养箱中孵育48 h。配制对CCK-8反应液,具体条件为CCK-8 ∶无血清培养基=1 ∶9(避光条件下)。去掉原先孔中培养基,将100 μl 配制好的反应液加入到每孔中,于37 ℃恒温培养箱孵育1～2 h。通过酶标仪进行吸光值检测,一般为 450 nm波长处,进而计算细胞存活率,采用 Graphpad8软件作图。

1.7 单核细胞诱导分化对人急性白血病单核细胞THP-1进行细胞计数,接种 1×106个单核细胞于6孔板中,加入 IL- 4 和 IL-13 刺激。IL- 4 和 IL-13 浓度均为 20 μg/ml。确定 IL- 4 和 IL-13 刺激时间2 d 时用ELISA、荧光定量PCR检测表面分子标志物的表达。结果显示,单核细胞表面IL-10 和 TFG-β的表达在 IL- 4 和 IL-13 刺激2 d 后明显增加。

1.8 ELISA实验根据ELISA试剂盒的说明,用人源IL10、 TGF-β的试剂盒,测出巨噬细胞TGF-β、IL10的水平。

1.9 Western blot实验弃掉培养皿的上清液,加入PBS溶液清洗,加入裂解液,于冰上静置15 min后,使用细胞刮刀收取悬液放入EP管,使用超声振荡后进行定量,再进行金属浴。之后上样、电泳和转膜。封闭后将抗体进行稀释Beta Actin(鼠 1 ∶3 000) 、PI3K(兔 1 ∶1 000) 、P-PI3K(兔 1 ∶1 000)、 AKT(兔 1 ∶1 000) 、P-AKT(兔1 ∶2 000) 、MMP9(兔 1 ∶1 000)、MMP2(兔1 ∶1 000)、E-Cadherin(兔 1 ∶1 000)、 N-Cadherin(兔 1 ∶1 000)。4 ℃过夜,次日用二抗孵育1 h,最后去显影。

1.10 划痕实验将细胞消化后离心,按照1×106个/ml放入6孔板中,待细胞贴壁占据90%面积。取6孔板内最大直径,用200 μl枪头沿着直尺快速划下,清洗2次,在倒置显微镜下进行拍照。

1.11 Transwell实验将细胞制成悬液,并计数2.5×105个/ml。在24孔板的下方加入700 μl含有20%FBS的培养基,用枪头将小室放入培养基上方。加入300 μl细胞悬液到小室。2 d后,将上清液吸出,在空白孔内加入500 μl结晶紫,将小室放入后清洗3次,清洗完毕使用固定液固定20 min,用棉签轻轻擦拭掉小室内壁的细胞,在倒置显微镜下进行拍照。

2 结果

2.1 M2型巨噬细胞的鉴定THP-1 细胞被 PMA 诱导 48 h成为 M0型肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages, TAM),然后被 IL-4 和 IL-13 诱导 48 h成为 M2-TAM,可以观察到细胞由圆饼形状转变成梭形(图1A、B),RT-qPCR实验检测巨噬细胞中M2型巨噬细胞相关标志物表达,结果表明,与M0巨噬细胞相比,诱导的M2型巨噬细胞极化标志物IL10、TGF-β升高(图1C,tIL-10=19.39,P<0.01;tTGF-β=17.13,P<0.01)。此外,ELISA实验检测巨噬细胞上清液中M2型巨噬细胞相关标志物也发生了同样改变。(图1D,tIL-10=42.56,P<0.01;tTGF-β=16.87,P<0.001)。

图1 M2型巨噬细胞的鉴定

图2 两组细胞分泌IL-6水平

2.2 M2型巨噬细胞的IL-6分泌在肿瘤微环境中,M2型巨噬细胞通常会分泌IL-6, ELISA实验表明了HCT116和M2型巨噬细胞的IL-6水平(图3,t=42.69,P<0.05)。

图3 M2型巨噬细胞上清液通过AKT/PI3K磷酸化促进HCT116迁移

2.3 M2型巨噬细胞上清液促进HCT116迁移,促进结直肠癌细胞AKT/PI3K磷酸化表达将HCT116分为两组,一组普通培养基培养作为对照,另外一组加M2型巨噬细胞上清液培养。Transwell实验、Western blot实验、划痕实验、RT-qPCR实验显示M2型巨噬细胞上清液培养的HCT116迁移能力增强(图3A、B,t划痕=113.8,P<0.01;tTranswell=30.13,P<0.05),Western blot实验显示条件培养基作用于HCT116后 MMP9、MMP2、N-Cadherin 蛋白水平上升,E-Cadherin蛋白水平下降(图3C)。MMP9、MMP2、N-Cadherin mRNA水平上升,E-Cadherin mRNA水平下降(图3D,tMMP9=9.356,P<0.05;tMMP2=11.45,P<0.01;tE-Cadherin=12.00,P<0.05;tN-Cadherin=5.973)。此外,Western blot实验显示条件培养基作用于HCT116激活了AKT/PI3K磷酸化表达。这部分的实验结果证明了M2型巨噬细胞上清液可以促进HCT116的迁移,在这个过程中激活了AKT/PI3K的磷酸化(图3E)。

2.4 BU对HCT116细胞活性的增殖影响CCK-8实验观察BU对HCT116细胞作用48 h后增殖活性的影响,BU对HCT116细胞的增殖活性具有抑制作用,且有浓度依赖性,本实验采用BU的非杀伤浓度12.5 nmol/L (IC30)(图4,F=922.1,P<0.001)。

图4 BU对HCT116的增殖活性影响

2.5 BU可以调节AKT/PI3K蛋白磷酸化抑制HCT116迁移能力将HCT116分为2组,一组加M2型巨噬细胞上清液作为对照,另外一组M2型巨噬细胞上清液加BU(12.5 nmol/L)培养。Transwell实验、Western blot实验、划痕实验、RT-qPCR实验显示BU可以抑制M2型巨噬细胞上清液促进HCT116迁移的效应(图5A、B,t划痕=72.63,P<0.01;tTranswell=26.38,P<0.05),Western blot实验从蛋白水平验证BU可以减弱HCT116的上皮间质化能力, MMP9、MMP2、N-Cadherin 蛋白水平降低,E-Cadherin蛋白水平上升(图5C)。同时RT-qPCR实验表明MMP9、MMP2、N-Cadherin 基因水平下降,E-Cadherin基因水平升高(图5D,tMMP9=100.01,P<0.000 1;tMMP2=11.45,P<0.01;tE-Cadherin=32.98,P<0.001;tN-Cadherin=5.973,P<0.01;)。设置普通培养基培养、巨噬细胞上清液、M2型巨噬细胞上清液加BU组验证BU抑制AKT/PI3K的磷酸化的作用。这部分的实验结果证明BU可以抑制HCT116迁移,抑制AKT/PI3K磷酸化。(图5E)。

图5 BU通过AKT/PI3K磷酸化抑制HCT116迁移

3 讨论

CRC是全世界癌症相关死亡的主要原因之一,CRC作为一种常见的恶性肿瘤,虽然治疗上有很大的进步,但CRC远处转移仍是患者病死率居高不下的罪魁祸首。肿瘤微环境主要是指成纤维细胞、巨噬细胞等非肿瘤细胞之间相互影响的场所,是肿瘤发生和发展的局部病理环境[9]。大量研究显示,肿瘤的发生和发展与M2型巨噬细胞等肿瘤微环境密切相关。肿瘤细胞通常可以通过重塑其肿瘤微环境,从而避开免疫系统,侵入底层间质,在恶劣的循环环境中存活,渗入其他人体的器官,塑造适合肿瘤生长的微环境,最后,长成临床可检测的转移病灶,而M2型巨噬细胞就参与了这一过程[10]。BU是我国已临床使用的华蟾素注射液的主要功效成分,目前临床上已经使用华蟾素来全身治疗多种肿瘤[11]。 研究[12]显示BU在抑制迁移和侵袭、逆转多药耐药、诱导细胞凋亡、抑制血管生成等抗肿瘤作用中发挥着至关重要的作用。

本研究中,将THP-1用试剂诱导成M2型巨噬细胞, Transwell、划痕实验和RT-qPCR实验显示结直肠癌细胞迁移和上皮间质转化能力增加。IL-6通过其受体 IL-6R对许多细胞发挥作用,在维持慢性炎症中起主要作用[13],此外,有研究[14]表明 IL-6作为一种促癌因子,促进肿瘤发展,并有助于CRC中慢性炎性和致瘤性微环境的形成。另外有研究[15]报道IL-6参与了AKT/PI3K信号通路的磷酸化过程 。ELISA实验显示M2型巨噬细胞分泌IL-6水平显著高于HCT116。Western blot实验中,M2巨噬细胞上清液可以激活HCT116中AKT/PI3K蛋白磷酸化,促进HCT116迁移和上皮间质转化。将BU加入M2巨噬细胞上清液培养HCT116,结果BU逆转了M2型巨噬细胞诱导的结直肠癌细胞迁移和上皮间质转化,并且减少了AKT/PI3K蛋白磷酸化。

综上所述,M2型巨噬细胞可以通过分泌IL-6使结直肠癌细胞HCT116迁移和上皮间质转化,并促进AKT/PI3K通路磷酸化,而BU能够抑制M2型巨噬细胞诱导的 HCT116 AKT/PI3K通路磷酸化。