长链非编码RNA SNHG1对结直肠癌增殖、迁移的影响及调控机制

曹 强

湘潭医卫职业技术学院，湖南 湘潭 411102

结直肠癌（CRC）是常见的消化系统恶性肿瘤，近年来，其发病率和死亡率呈快速增长趋势［1-2］。尽管CRC 诊疗技术不断改进，但CRC的死亡率仍然较高，主要原因与CRC 早诊率低、转移复发率较高、敏感性分子靶向药物较少等因素有关，因此，探索CRC新的诊断标志物，发现其增殖、迁移相关分子靶标对于CRC临床诊断、治疗尤为重要。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的转录本，不能翻译蛋白质，其在表观遗传、转录及转录后水平通过对靶基因调控参与众多病理生理过程［3］。研究表明，lncRNA 与CRC 增殖、侵袭、迁移等生物学过程密切相关［4］。小核仁RNA 宿主基因1（SNHG1）是位于染色体11q12.3 的新型lncRNA，其在神经母细胞瘤、肺癌、骨肉瘤等恶性肿瘤的发生发展中发挥着重要的调控作用［5］。SNHG1 在CRC 中的生物学功能及调控机制，目前研究报道较少，本研究旨在探讨SNHG1 对CRC 增殖、迁移的影响及潜在的调控机制，以期为CRC潜在肿瘤标志物及药物治疗靶标的发现提供新的理论依据。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞系、主要试剂和仪器

人正常结直肠上皮细胞系FHC、结直肠癌细胞系HT29 均购自中科院上海细胞库。DMEM 培养基、胎牛血清购自江苏齐氏生物科技有限公司。胰蛋白酶购自厦门海标科技有限公司。青霉素、链霉素购自上海择叶生物科技有限公司。磷酸盐缓冲液PBS 购自广州威佳科技有限公司。蛋白裂解液购自上海康朗生物科技有限公司。qPCR试剂盒购自江苏天净沙基因诊断技术有限公司。引物、SNHG1 小干扰RNA 序列，阴性对照序列均由上海康颜生物科技有限公司设计合成。脂质体liPofectamine2000 购自北京沃比森科技有限公司。四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司。STAT3、P-STAT3 抗体购自上海钦城生物科技有限公司。超净工作台购自济南腾昊科学仪器有限公司。细胞培养箱购自上海合恒仪器设备有限公司。SH2-16K 离心机购自深圳三莉科技有限公司。164-5050 电泳仪购自济南爱来宝仪器设备有限公司。倒置显微镜购自上海工洲阀门有限公司。Transwell 小室购自北京优尼康科技有限公司。Tanon2500 凝胶成像仪购自上海橙诚科学仪器有限公司。

1.2 细胞培养、转染和分组

将复苏后的FHC、HT29 细胞接种于含1%青霉素-链霉素双抗、10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养，置于37 ℃、5%CO2培养箱中进行常规培养。48 h后倒置显微镜下观察细胞生长情况，弃去培养液、PBS 清洗3 遍，加入0.5 mL 事先配置好的胰蛋白酶消化液充分消化。当细胞消化至变圆时弃去消化液终止消化，加入5 mL DMEM 培养液反复吹打，使细胞呈单细胞悬液状态，1 200 r/min 离心5 min，弃上清，收集HT29 细胞，加入MEM 培养液，调整细胞密度至4×104个/mL，吸取3 mL HT29 细胞悬液于6孔板中，置于细胞培养箱中培养，待细胞生长汇合度达到70%～80%时进行细胞转染操作。按照liPofectamine 2000转染试剂说明书分别将SNHG1 小干扰RNA 序列（si-SN⁃HG1）、阴性对照序列（si-NC）转入HT29细胞，并将其设置为si- SNHG1组和si-NC组。

1.3 qRT-PCR

胰酶消化并收集各组处于对数期生长的细胞于6 孔板中，每孔加入150 μL Trizol 试剂，反复吹打细胞，移入无Rnase的EP管中，加入250 μL氯仿，振荡混匀后12 000 r/min离心10 min，小心吸去上层液于另一个无RNase 的EP 管中，加入等体积异丙醇充分混匀，用同样方法离心，弃去上清，加入1 mL 75%乙醇，7 500 r/min 离心5 min，弃上清，置于冰上晾干，采用分光光度计测量RNA 浓度。取1 μgRNA 为模板逆转录为cDNA，采用qPCR 试剂盒检测SNHG1 mRNA 表达水平，以GAPDH 为内参，采用2－△△CT法计算SNHG1相对表达量。

引 物 序 列： SNHG1 上 游 5'-CCTAAAGCCAC⁃GCTTCTTG-3'，下游5'-TGCAGGCTGGAGATCCTACT-3'。GAPDH上游5'-TGTAGGCTCATTTGCAGGGG-3'，下游5'-ATGGCATGGACTGTGGTCTG-3'。

1.4 MTT

将si-SNHG1 组和si-NC 组细胞以每孔2×103个细胞密度接种于96孔板，每组设置3个复孔，置于37℃培养箱中培养。培养24 h、48 h、72 h，每孔加入20 μL MTT试剂，培养箱中避光孵育3 h，弃去培养液，并加入100 μLDMSO试剂，充分振荡，酶标仪检测各孔490 nm处光密度（OD）值，OD值大小表示细胞增殖活性强弱。

1.5 Transwell

胰酶消化并收集处于对数期生长的si-SNHG1 组和si-NC 组细胞。采用不含胎牛血清的DMEM 培养液重悬细胞，将细胞密度调整为2×105/mL，将Transwell 小室置于24 孔板中，取100 μL 上述细胞悬液加入Transwell 上室，Tran⁃swell 下室加入600 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培养液，37 ℃培养箱中培养24 h，甲醇固定10 min，结晶紫染色15 min，无菌棉签擦去未穿膜的HT29 细胞，显微镜观察并随机取6个视野并计算迁移细胞个数。

1.6 Western blot

分别收集处于对数期生长的si-SNHG1组和si-NC组细胞于离心管中，加入RIPA 裂解液，置于冰上裂解10 min，离心取上清液，采用BCA法测定蛋白质浓度。根据说明书配置SDS-PAGE 胶，每孔上样量为25 μg蛋白质，进行SDS-PAGE 凝胶电泳，电泳结束后，将蛋白质转移至PVDF 膜上，室温下5%的脱脂牛奶封闭2 h。加入一抗（STAT3、P-STAT3 稀释浓度均为1∶1 000），4 ℃下孵育过夜，TBST 充分洗膜后，使用辣根酶二抗标记物室温下孵育2 h。采用化学荧光发光法（ECL）显影，以GAP⁃DH 为内参，Image J 软件分析目的蛋白和内参光密度值，将目的蛋白与内参GAPDH 光密度比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG1在CRC 细胞系HT29、结直肠上皮细胞FHC 中的表达

qRT-PCR 检测CRC 细胞系HT29、结直肠上皮细胞FHC 中SNHG1 的表达水平，HT29、FHC 细胞中SNHG1 的相对表达量分别是（4.26±0.15）、（1.06±0.08），与FHC 细胞相比，HT29 中SNHG1 的表达水平显著升高，差异有统计学意义（t=17.045，P=0.000）。

2.2 干扰SNHG1表达对HT29细胞增殖、迁移的影响

si-SNHG1 组、si-NC 组HT29 细胞中SNHG1 表达分别是（1.21±0.07）、（4.15±0.32），si-SNHG1 组显著低于si-NC 组（t=16.317，P=0.000）。MTT 实验结果显示，si-SN⁃HG1 组HT29 细 胞在培养24h 的OD 值与si-NC 组，差异无统计学意义（t=2.014，P=0.079），但在48 h、72 h 的OD值显著低于si-NC 组，差异有统计学意义（t=5.173，P=0.006；t=8.426，P=0.002）。Transwell 迁移实验结果显示，si-SNHG1 组HT29 细胞迁移数明显低于si-NC 组，差异有统计学意义（t=12.714，P=0.001），见表1。

表1 干扰SNHG1表达对HT29细胞增殖、迁移的影响（±s）

组别si-NC（n=3）si-SNHG1（n=3）t值P值SNHG1 4.15±0.32 1.21±0.07 16.317 0.001细胞活性（OD490 nm）24 h 0.37±0.03 0.34±0.03 2.014 0.079 48 h 0.59±0.07 0.42±0.04 5.173 0.006 72 h 0.91±0.08 0.51±0.06 8.426 0.002细胞迁移数（个）67.48±7.14 25.13±6.37 12.714 0.001

2.3 干扰SNHG1 表达对JAK-STAT 信号通路相关蛋白表达的影响

Western blot 检测si-SNHG1 组、si-NC 组HT29 细胞中STAT3、P-STAT3 的表达，其表达量分别为（0.73±0.09）、（0.71±0.15）；（0.23±0.06）、（0.68±0.14），STAT3 在si-SN⁃HG1 组和si-NC 组中的表达，差异无统计学意义（t=1.063，P=0.084），与si-NC 相 比，P-STAT3 在si-SN⁃HG1组中的表达明显降低，差异有统计学意义（t=15.473，P=0.000）。

3 讨论

CRC 是我国常见的消化道恶性肿瘤，CRC 早期症状隐匿，缺乏特异性、敏感性较高的诊断标志物，大多数发现时已处于中晚期并伴有局部浸润和转移，导致CRC患者总体生存率较低。CRC 发病机制较为复杂，至今尚未完全阐释，其涉及体内外多种因素，包括饮食习惯、生活方式的变化；吸烟饮酒等不良生活习惯；遗传和表观遗传学的改变等。因此，深入探索CRC 发生发展的分子机制，对于CRC 特异性标志物的发现，CRC 新型分子靶点药物的开发具有重要的临床应用价值。lncRNA 是一类长度超过200个核苷酸，无编码蛋白功能的转录本，在肿瘤发生、增殖、迁移等生物学过程中发挥着重要的调控作用。已有研究表明，多种不同类型的lncRNA 参与CRC 进展，Zhang 等［6］采用qRT-PCR 检测临床CRC 原发癌组织及转移癌组织中lncRNA H19 的表达，发现其表达显著上调并与CRC 不良预后呈正相关，过表达lncRNA H19 可促进CRC 细胞迁移及EMT 的 发生。此外，lncRNA AGAP2-AS1 在CRC 中 表达同样上调并参与CRC 进展［7］。体内实验研究同样表明lncRNA 参与CRC 发生发展调控，Shang 等［8］通过构建异种移植瘤模型，发现敲低lncRNA CCAT1 组移植瘤生长受到明显抑制。另有研究指出，部分lncRNA 在CRC 中可发挥抑癌作用，Lin 等［9］通过对CRC 癌旁组织与原发癌组织中lncRNA AGER-1 表达进行比较发现，其在原发癌组织中的表达显著下调，与CRC 临床分期呈负相关，过表达AGER-1 可抑制CRC 增殖、迁移，诱导细胞周期阻滞，促进凋亡。lncRNA 在CRC 中具有促癌和抑癌双重作用，不同类型的lncRNA 在CRC 中可能发挥不同的作用，因此，lncRNA在CRC中的功能有待进一步深入探讨。

SNHG1 是近年来新发现的lncRNA，其在多种不同类型的肿瘤中发挥促癌作用。Liu 等［10］研究表明SNHG1 在宫颈癌组织及细胞中的表达均上调，沉默SNHG1 可显著降低宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力。SNHG1在脑膜瘤中同样具有促癌作用，SNHG1 在脑膜瘤细胞中呈高表达，敲低SNHG1 后可抑制脑膜瘤细胞生长［11］。Meng 等［12］检测了前列腺癌组织和癌旁组织中SNHG1 的表达，结果SN⁃HG1均呈现高表达，并进一步通过细胞实验验证其对前列腺癌增殖、迁移、凋亡的影响，转染SNHG1 干扰RNA 可明显抑制前列腺癌细胞增殖、迁移，促进其凋亡。本研究探讨了SNHG1 在CRC 中的表达及功能，结果SNHG1 在CRC HT29细胞的表达明显高于结直肠上皮FHC细胞，表明SN⁃HG1 在CRC 中有可能同样发挥促癌效应，为验证SNHG1在CRC 中的促癌效应，进一步对SNHG1 能否促进CRC 增殖、迁移进行了研究，以HT29 细胞作为研究细胞，通过转染si-SNHG1 RNA 以沉默SNHG1，MTT 增殖实验结果表明，si-SNHG1组HT29细胞增殖能力在培养48 h、72 h时显著低于si-NC 组，Transwell 迁移实验结果表明，si-SNHG1组HT29 细胞迁移能力显著低于si-NC 组，提示SNHG1 能够通过促进CRC增殖、迁移，发挥其促癌效应。

酪氨酸激酶-信号转导子与转录激活子（JAK-STAT）信号通路是由多种细胞因子介导的细胞内外信号转导通路，JAK-STAT信号通路广泛参与细胞分化、增殖、凋亡、免疫调控、炎症反应、肿瘤发生发展等病理生理过程［13-14］。已有研究表明，JAK-STAT 信号通路在多种不同类型肿瘤进展过程中发挥着关键作用。Huang 等［15］研究发现JAK-STAT 信号通路在膀胱癌中呈活化状态，使用JAK-STAT 阻断剂可显著抑制膀胱癌细胞增殖活性。C/EBPβ 通过上调JAK-STAT 信号通路活性促进乳腺癌增殖、侵袭及迁移［16］。此外，JAK-STAT 信号通路在肝癌中的活性同样升高，Zhang等［17］采用qRT-PCR、Western blot等方法检测了肝癌组织和癌旁组织中JAK2、STAT3 mRNA和蛋白的表达，结果其在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织。另有研究报道指出，JAK-STAT 信号通路在CRC 中活化并参与CRC 进展。Fang 等［18］体外验证了CPEB3 蛋白可抑制CRC 增殖、迁移，敲低CPEB3 蛋白表达后可上调JAK-STAT 信号通路活性并促进CRC 进展。在本研究中，为了进一步验证SNHG1 促CRC 增殖、迁移的分子机制，我们探讨了SNHG1与JAK-STAT 信号通路的相关性，采用Western blot 实验方法检测了si-SNHG1 组、si-NC 组HT29细胞中STAT3、P-STAT3的表达，结果STAT3在两组细胞中的表达无明显差异，与si-NC 相比，P-STAT3在si-SNHG1组中的表达明显降低，STAT3 是JAK-STAT 信号通路中关键转录因子，其磷酸化被认为是该信号通路活化的重要标志，该实验结果提示SNHG1 促CRC 增殖、迁移作用与JAK-STAT信号通路活化有关。

综上所述，lncRNA SNHG1 在CRC 中呈高表达并能够促进CRC 增殖、迁移，在调控机制方面，lncRNA SNHG1通过上调JAK-STAT 信号通路活性进而发挥其促癌效应。本研究初步探讨了lncRNA SNHG1 对CRC 增殖、迁移的影响及调控机制，将为CRC临床诊治提供新的实验依据。