锌诱导对力竭运动大鼠金属硫蛋白的影响及其对心肌的保护作用

宋　晨　张　钧

摘要：通过预先用锌诱导后大鼠做力竭性运动，来观察锌诱导金属硫蛋白（MT）合成对心肌的保护作用及其可能机制。方法：选用健康雄性SD大鼠30只，体重220～250 g，随机A、B、C分为3组，即：A组为对照组；B组为一次性力竭运动组；C组为锌+一次性力竭运动组，每组10只。满8周后，测定其心肌组织中的MT含量、组织中钙的含量、巯基（-SH）和丙二醛（MDA）含量、以及心肌中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）和Na+-K+-ATP酶的活性。结果：1) 与对照组相比，力竭运动组大鼠心肌组织中MT的含量较对照组显著降低（P<0.05）；心肌组织中MDA含量和总钙量显著增高（P<0.05）；-SH含量以及GSH-px活性和Na+-K+-ATP酶的活性显著降低（P<0.05）。2) 与力竭运动组相比；锌＋力竭运动组大鼠心肌组织中MT含量较力竭运动组显著增高（P<0.05）；心肌组织中MDA含量和总Ca2+量显著降低（P<0.05）；-SH含量及GSH-px活性和Na+-K+-ATP酶的活性显著增高（P<0.05）。结论：预先用锌诱导可减少力竭运动后心肌组织中MT含量的显著下降，降低心肌组织脂质过氧化水平，提高抗氧化酶的活性，防止钙超载，对力竭运动后心肌细胞的损伤具有保护作用。MT和金属锌密切相关，二者的相互作用可能共同参与保护力竭运动后机体组织的损伤，并促进损伤组织的快速修复。

关键词：金属硫蛋白； 运动； 锌；心肌细胞

中图分类号：G804.21文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)02-0196-03

金属硫蛋白（MT）是一类富含半胱氨酸的低分子量金属结合蛋白，具有多种生物效应。它可清除氧自由基，尤其是清除超氧自由基和羟自由基，是一种强的内源性细胞保护物质,在保护心血管系统损伤中发挥着重要作用。金属硫蛋白可由多种因子诱导产生，其中与锌密切相关。锌是机体必需微量元素，具有广泛的生物效应，两者相互影响对机体正常的生理功能起着重要的作用。本研究预先用锌诱导后大鼠做力竭运动，来观察锌诱导MT合成对心肌的可能保护作用。

1研究对象与方法

1.1实验动物、分组选用健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只（购自中科院上海实验动物中心），体重220～250 g，分笼饲养，每笼5只，饲养笼选用塑料制品，并配有不锈钢罩，塑料吸水瓶和不锈钢吸水管，自然光照，饲养环境温度21～24°C，自由饮食、饮水。

1.2研究方法

1.2.1运动安排大鼠购进后，先适应性喂养两天，称重后，随机分为A、B、C、三组，每组10只：A组为安静对照组：常规饲养，不加干预。B组为一次性力竭运动训练组：常规饲养，不加干预。大鼠处死前3 d，让大鼠做适应性游泳运动，游泳池为一150 cm×60 cm×70 cm长方体，水深50 cm，水温(32±1)℃。每天1次，时间为30 min，满8周后，大鼠做一次性力竭游泳运动，力竭判断标准按Thomas文献报道［1］。C组为锌＋一次性力竭运动组：饲养与

运动条件同B组，只是在大鼠处死前一天，大鼠腹腔注射ZnSO4（0.2 mmol/L，1.5 mL/kg），24 h后，让大鼠做一次性力竭运动。力竭判断标准同C组。

1.2.2取材制备所有运动组大鼠，运动后即刻大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉取血，肝素抗凝。另取心室肌组织，去血污，置于液氮保存以备待用。

1.2.3测试方法

1.2.3.1红细胞溶血素的制备正常大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉取血，肝素抗凝。取4 mL血样，加2倍血样体积的1.15%氯化钾溶液洗3次，3 000 r/min离心10 min，弃去上清液。洗净的红细胞加20 mL 0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL缓冲液，室温放置10 min，4 000 r/min离心20 min，上清液保存于4℃冰箱中备用。

1.2.3.2MT的提取及测定用镉饱和法［4，5］略加改进测定MT。将取出的心室肌放入小平皿中，用生理盐水洗净、吸干水份后称取1.00 g。加4 mL 0.05 mol/L Ph8.0 Tris-HCL缓冲液，充分匀浆后，以20 000 r/min离心60 min。取上清液0.2 mL，加1.0 mL0.089 mmol/L镉溶液、0.5 mol/L Ph8.0 Tris-HCL缓冲液2.2 mL，混匀后静置10 min，再加0.2 mL红细胞溶血素，混匀后置100℃水浴3 min，然后以3 000 r/min离心10 min，弃去沉淀物。再加0.2 mL红细胞溶血素，混匀后置100℃水浴3 min，然后以3000 r/min离心10 min，重复两次加红细胞溶血素，上清移入带塞试管中4℃保存待测。用火焰原子吸收分光光度计测定上清夜中镉的含量，再按1分子MT键合6分子镉换算成MT的含量。用考马斯亮蓝法测定样本蛋白含量。

1.2.3.3大鼠心肌中Ca2+含量的测定另取心室肌组织，用预冷生理盐水制备匀浆，4层纱布过滤后取匀浆液，离心取上清液，用火焰原子吸收分光光度计测定上清夜中Ca2+的含量。蛋白定量方法同上。

1.2.3.4其他用MDA、-SH、GSH-px和Na+-K+-ATP酶试剂盒分别测定心肌组织中MDA和-SH含量、GSH-px和Na+-K+-ATP酶的活性，以上试剂盒均有南京建成生物公司提供。严格按照试剂盒操作步骤进行。

1.2.4试剂与仪器 试剂镉标准液（［GBW（E）080119］由国家标准物质研究中心提供）；ZnSO4（去离子水配制）；0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL缓冲液（0.1 mol/L Tris溶液+0.1 mol/L盐酸溶叶29.2 mL+水至100 mL）。仪器：超速低温离心机（HITACHI55P-72型）；SAS/727原子吸收分光光度计，721-分光光度计。

1.2.5统计学分析所有数据以均数±标准差（x±S）表示，用t检验进行显著性分析。

2结果

2.1锌诱导对力竭运动后大鼠心肌组织中MDA、-SH、GSH-px含量影响

由表1可知，一次性力竭运动组大鼠心肌组织中MDA含量较安静对照组显著增加，而锌＋一次性力竭运动组大鼠心肌组织中MDA则较力竭运动组有显著性降低（P<0.05）；一次性力竭运动组大鼠心肌组织-SH含量和GSH-px含量较安静对照组有显著性降低，而锌＋一次性力竭运动组大鼠较一次性力竭运动组大鼠有显著性提高（P<0．05）；说明一次性力竭运动可造成心肌组织产生大量的自由基，造成心肌组织膜脂质过氧化水平增高，细胞受到损伤。用锌预先诱导后，可改善力竭运动心肌组织中抗氧化酶的活性，增强心肌组织抗氧化的能力，对心肌细胞的损伤有一定的保护作用。

2.2锌诱导对力竭运动后大鼠心肌组织中Ca2+含量、Na+-K+-ATP酶活性的影响

由表2可知，一次性力竭运动组大鼠心肌组织中Ca2+浓度较安静对照组大鼠显著性增加（P<0.05），而锌＋一次性力竭运动组大鼠心肌组织中Ca2+浓度则较一次性力竭运动组大鼠有显著性降低（P<0.05）；一次性力竭运动组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATP酶的活性较安静对照组大鼠显著性降低（P<0.05），而锌＋一次性力竭运动组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATP酶的活性较一次性力竭运动组大鼠显著性提高（P<0.05）；说明一次性力竭运动可造成心肌细胞内钙超载和Na+-K+-ATP酶的活性降低，造成心肌细胞膜功能障碍，使心肌细胞受损。预先用锌诱导可在一定程度上缓解力竭运动造成的心肌损伤。

2.3锌诱导对力竭运动后大鼠心肌组织中MT含量的影响

由表3可知，一次性力竭运动组大鼠心肌组织中MT的含量较安静对照组大鼠显著性降低（P<0.05），锌＋一次性力竭运动组大鼠较力竭运动组大鼠显著性提高（P<0.05）；说明一次性力竭运动可造成心肌组织中MT含量的降低，而用锌预先诱导后的大鼠可使心肌组织中MT维持在一定的水平，对力竭运动造成的心肌损伤有一定保护作用。

3讨论

本实验结果显示，力竭运动后大鼠心肌组织中MT的含量降低。Shinogi等报道，没经训练的大鼠剧烈跑步运动后肝脏MT出现升高，在6 h时达到高峰，然后逐渐下［4］。运动恢复期后肝脏MT的大量升高，可能与自由基的清除有关。艾华等实验结果显示：大鼠急性游泳运动后即刻，肝脏MT含量已经明显升高，游后6 h含量大最高，随后下降。这表明急性运动可诱导MT的大量合成［5］。这与Shinogi实验报道一致。另外，艾华等实验也发现，经游泳训练的大鼠力竭运动后，骨骼肌和肝脏MT的高峰值均在3 h处，表明运动训练可使MT对运动应激的诱导合成加快［6］。运动训练促进机体MT基础水平增高和加快MT对运动应激的诱导合成，均有利于清除运动中产生的自由基。然而李昭波实验发现急性运动24 h后肝脏、心脏等组织中的MT含量普遍升高［7］。而本实验结果与上述实验结果不一致，可能和运动方式、运动时间、取样时间和取样组织不同有关。力竭运动造成心肌组织MT含量下降的原因可能是由于随着运动的时间延长，自由基产生的量超过MT合成的量，MT在抗氧化的同时本身也被消耗，致使MT的含量降低。本实验发现，在力竭运动前补充Zn2+可使力竭运动后心肌组织中GSH-px的活性显著增高、Ca2+浓度显著降低、MDA的含量显著降低，-SH含量和Na+-K+-ATP酶活性升高，MT含量显著增加。说明用Zn2+预先诱导可缓解力竭运动造成的心肌组织的损伤，促进机体向良性趋势发展。其机制可能与锌预先诱导MT的合成增加有关。

锌是机体必需微量元素，具有广泛的生物效应。MT中含有7个锌离子，锌离子的缺乏会导致机体MT合成的障碍。肝细胞中的锌离子可以调节肝脏MT的基因表达，两者呈正相关系。Zn2+是MT合成的强诱导剂，可促进心肌成纤维细胞的合成［8］。在力竭运动前用Zn2+预先诱导心肌组织中MT合成增加，在力竭运动时MT与氧自由基作用，当已结合Zn的MT巯基受到氧化时，Zn2+就从MT中释放出来，发挥修复组织和抗炎作用，在一定程度上减缓了力竭运动造成的心肌细胞损伤。MT也为一些含锌酶提供锌，锌离子是自由基清除剂，通过参与抗氧化系统的一些酶发挥作用。从而维持抗氧化酶的活性，减少心肌组织的损伤。锌离子的含量下降将严重影响这些酶的活性，降低自由基的清除能力。最近的研究显示，锌的抗氧化作用是通过其诱导的MT合成增加来实现的，锌对损伤细胞的保护作用也与MT合成增加有关［9］。推测MT可能参与心肌损伤状态下心肌细胞的保护作用。其保护机制可能是通过减少脂质过氧化，促进酶活力的升高，减少自由基对细胞膜的损伤，减轻因酶活力下降和膜损伤引起的细胞通透性升高，改善细胞内外的离子紊乱，调节细胞内外钙的的稳态，维持心肌的正常功能［10］。柯琴梅等［11］实验结果表明，大鼠腹腔注射ZnSO4 24 h后心肌中MT有较高的表达，与对照组相比，Zn2+诱导组心脏对缺血/再灌注（I/R）损伤的抵抗也增强，表现心肌细胞膜损伤减轻（表现为LDH及CK漏出量减少），心肌超微结构损伤减轻，抑制了MDA的产生（清除自由基），心肌代谢改善（表现为ATP耗竭减少），增强了心肌功能（可能与抑制Ca2+内流）有关［12］。MT具有清除羟自由基、稳定细胞膜、抑制细胞钙超载及促进抗氧化酶的活力升高等生物学作用。MT这些作用是MT抗心肌缺血再灌注损伤损伤的主要原因。

金慧英等实验证明MT可通过保护抗氧化酶（SOD、GSH-px）活力，来减轻缺氧复氧所致的心肌损伤［10］。所以外源性补充MT或Zn2+预先诱导合成MT增加可减轻缺血缺氧造成心肌损伤，能有效地对抗力竭运动状态下心肌损伤。葛淑君的研究显示：MT能有效的拮抗氧自由基对线粒体的损伤，减轻其对Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性和Ca2+的转运能力的抑制作用［13］。李兆萍等的实验发现无论是外源性或内源性MT都能显著地抑制钙反常时心肌钙含量的增加，由于Cd、Zn等离子是钙通道的竞争抑制剂和Na+-Ca2+交换抑制剂，MT可结合这些金属离子而阻止钙内流，避免细胞钙超负荷的发生，这可能是MT具有细胞保护作用又一机制［14］。

本实验结果显示：力竭运动组大鼠MT的含量降低，可能与锌含量不足有关。锌诱导组大鼠心肌组织中MT的含量显著增高，可能与锌预先诱导增加MT合成有关。在运动中，贮存锌离子的MT对锌需求量增加，锌量充足增强了MT的基因表达信号，使MT的合成增加。实验发现Zn2+诱导MT的表达减轻大鼠心肌I/R损伤，其机制涉及MAPK途径［15］。

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