尿毒清颗粒改善链佐星-弗氏完全佐剂诱导的糖尿病肾病模型肾脏功能的研究

李 璇， 王 琼， 何 宝， 孙雪莹， 孙小玉， 李晓冬， 朱 荃(南京中医药大学国家规范化中药药理实验室，江苏南京210029)

DN是糖尿病最严重的微血管病变之一，严重影响糖尿病病人生存健康，终末期肾病中有1/3是由糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)发展而来的［1］。蛋白尿和肾小球滤过率(glomerilar filtration rate，GFR)是评价肾脏功能及其改变的主要指标。微量白蛋白尿的出现标志着DN的开始，而持续的蛋白尿则是判定DN及其严重程度的指标。Ccr可用肌苷清除率(creatinine clearance rate，Ccr)来衡量［2］。肾小球基底膜增厚，肾小球胞外基质增宽是DN最主要的病理学改变［3］，所以肾小球损害是DN发生发展过程中最重要的环节。

尿毒清颗粒是广州康臣药业公司上市十年的以尿毒症为主治的中药复方制剂，主要由大黄、黄芪、甘草、茯苓、白术、制何首乌、川芎、菊花、丹参、姜半夏组成，具有通腑降浊，健脾利湿，活血化瘀的功效。但尚未见到该制剂对DN的影响的报道。本实验以链佐星(Streptozotocin，STZ)－弗氏完全佐剂(Complete Freund’s Adjuvant，CFA)诱导大鼠 DN模型，观察尿毒清颗粒对的DN的改善作用及其可能的机制，探讨该制剂用于DN治疗的可能性。

1 实验材料

1.1 药品与试剂 尿毒清颗粒，广州康臣药业有限公司;STZ，CFA，山梨出脱氢酶，D－山梨醇，sigma;优越血糖试纸，美国罗氏诊断公司;葡萄糖、尿素氮、肌酐、SOD、MDA、考马斯亮兰测定试剂盒，南京建成生物工程研究所;尿白蛋白测定试剂盒，南京聚力生物医学工程研究所;NADH，中国医药(集团)上海化学试剂公司;甘氨酸，上海康达氨基酸厂;IV型胶原，CHEMICON International Inc;二抗，晶美生物工程有限公司;DAB显色系统，Gene Tech Biotechnology Company Limited;枸橼酸、枸橼酸钠等化学试剂均为市售分析纯。

1.2 动物与仪器 SPF级Wistar大鼠，♂性，体重160～180 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号:SCXK(沪)2003－0003;Accu－Chek Advantage血糖仪，美国罗氏诊断公司;SPECTRAmax190，美国Molecular Devices Corporation;Spectra MAX GEMINIXS，美国 Molecular Devices Corporation。

2 实验方法

大鼠70只，随机分为两组，正常对照组10只，造模组60只，动物自由饮水、进食，参考文献方法［4］制作DN大鼠模型。造模合格动物40只分为:模型组，尿毒清颗粒0.6、1.8、5.4 g/kg组，每组10只，使组间血糖值无差异，正常对照组不变。药物组分别灌胃给予相应药物，同体积不同浓度给药，模型组给予同体积生理盐水，每日一次，连续14周;造模组饲以10%高脂饲料，正常对照组常规饲养。

样本采集及指标检测:实验结束后，单笼收集24 h尿液，测定尿液体积、总蛋白、白蛋白水平并计算24 h总蛋白和白蛋白排出量;秤体重，取血，分离血清，测定葡萄糖、尿素氮、肌酐、糖基化终产物(AGE)、SOD、MDA;分离红细胞，制成50%红细胞悬液，反复3次冻融破膜，按体积比1:2加入无水乙醇沉淀蛋白，3 000 r/min离心，上清－20°C冻存，用于测定红细胞内山梨醇含量;取两侧肾脏，称重，一侧制成20%肾匀浆，亦按上述方法沉淀蛋白、保存，用于测定肾脏中山梨醇含量;另一侧肾脏置10%福尔马林溶液中固定，脱水，石腊包埋，常规HE及PAS染色，光学显微镜观察病变并评分，肾脏病变包括(1)肾小球系膜基质增生程度;(2)肾小管有无变性;(3)肾小管有无糖原沉积;(4)间质及肾盂有无炎症、纤维组织增生及其严重程度。参照Bilous［5］分级方法，根据病变由轻到重的程度分别标记为1分、2分、3分、4分，无病变者记为0分，累加系膜基质增生及肾小管内糖原沉积所得分数，并计算出每组均分，分值越高提示DN病变程度越高;OPTAMS软件分析PAS染色切片紫红色占肾小球面积百分比;免疫组化法检测Collanges IV表达并以OPTAMS软件作图像分析，计算棕黄色表达部位的面积占肾小球面积的百分比:

山梨醇与AGE含量的测定:

参照 Gupta［6］方法，取样本 100 μL 加入 Spectra MAX GEMINIXS专用黑色96孔板中，再加入酶反应液(0.2 mol/L甘氨酸－NaOH缓冲液(pH 9.4)含8 U山梨醇脱氢酶和0.6 mmol/L NAD+)100 μL，37°C保温30 min，367/455 nm(激发光/发射光)测定荧光值，并代入标准曲线换算，计算出待测样品种山梨醇的含量。参照Munch［7］方法测定AGE水平。

酶法测定山梨醇标准曲线的绘制:配制浓度为2.5×10－4mol/L山梨醇溶液，并分别稀释至如下浓度:1.25 × 10－4mol/L、2.5 × 10－5mol/L、1.25 ×10－5mol/L、6.25 ×10－6mol/L。各浓度山梨醇标准液各取100 μL，如上法测定，并绘制标准曲线。

肌酐清除率的计算:肌酐清除率(Ccr)=尿肌酐×每分钟尿量(ml)/血肌酐，以体重校正。

3 结果

3.1 尿毒清颗粒对STZ－CFA联合诱导的大鼠DN模型体重、进食量的影响 如图1所示，模型组动物体重明显降低，进食量明显增加。尿毒清颗粒对DN大鼠体重没有明显影响，但可明显减少大鼠的进食量。

3.2 尿毒清颗粒对STZ－CFA诱导的DN动物模型大鼠尿液指标的影响 如表1可见，模型组动物24 h尿量、总蛋白和白蛋白排出量增加;尿毒清颗粒1.8 g/kg、5.4 g/kg可明显减少DN大鼠24 h尿量，降低24小时总蛋白和白蛋白的排出量。未观察到尿毒清颗粒0.6 g/kg对上述指标有明显影响。

图1 尿毒清颗粒对STZ-CFA诱导的DN模型体重(A)、摄食量(B)的影响

表1 尿毒清对DN大鼠24 h尿量、总蛋白、

3.3 尿毒清颗粒对STZ－CFA诱导的大鼠DN模型生化指标的影响 DN动物血糖明显升高，尿毒清颗粒1.8 g/kg、5.4 g/kg给药11周可后可降低DN大鼠血糖;DN大鼠血清丙二醛(MDA)、血肌酐、血尿素氮、糖基化终产物(AGEs)水平显著升高，超氧化物歧化酶(SOD)显著降低。尿毒清颗粒1.8 g/kg、5.4 g/kg可明显降低总胆固醇、MDA、血肌酐、血尿素氮、AGEs、LDL水平，提高血清SOD活性(表2、表3)。

3.4 尿毒清颗粒对STZ－CFA诱导的DN大鼠Ccr、肾指数及山梨醇含量的影响 DN大鼠肌酐清除率明显降低，肾脏重量、肾指数、红细胞及肾脏匀浆中山梨醇含量明显增高;尿毒清颗粒1.8 g/kg、5.4 g/kg能显著增加DN大鼠肌酐清除率，减轻肾脏重量、降低肾指数及红细胞、肾匀浆中的山梨醇含量，尿毒清颗粒0.6 g/kg可明显降低红细胞内山梨醇的含量，未观察到对其他指标有明显影响(表4)。

表2 尿毒清颗粒对DN大鼠血糖的影响(n=10，±s)

表2 尿毒清颗粒对DN大鼠血糖的影响(n=10，±s)

注:1、3、7、11周血糖值由罗氏公司血糖仪及试纸条测出，14周血糖值由葡萄糖试剂盒测出。*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比。

组别 剂量/(g/kg)给药期血糖/(mmoL/L)1周 3周 7周 11周 14周对照 － 4.6±0.4** 4.6±0.5** 4.7±0.5** 4.9±0.8** 4.9±1.0**模型 － 25.3±4.7 22.3±3.5 25.0±6.1 22.9±3.4 19.5±2.0尿毒清 0.6 25.4±5.0 21.8±3.9 25.8±5.5 23.1±5.6 19.1±2.4颗粒 1.8 25.0±4.8 22.1±6.8 19.7±9.0 19.8±3.1* 17.7±1.5*5.4 24.7±4.7 22.4±6.6 21.6±9.0 19.0±3.7* 17.2±2.3*

表3 尿毒清对DN大鼠血清生化指标的影响(n=10，±s)

表3 尿毒清对DN大鼠血清生化指标的影响(n=10，±s)

注:*P ＜0.05，**P＜0.01，与模型组相比。

剂量SODMDA血肌酐 血尿素氮AGEs组别 /(g/kg)/(U/mL)/(nmol/L)/(umol/L)/(mmol/L)/U对照 － 525±26** 4.4±0.7** 71.7±19.2** 6.5±0.7** 264±53**模型 － 481±25 9.3±2.6 96.3±13.4 7.9±1.3 351±59尿毒清 0.6 498±33 7.8±2.3 91.0±31.1 7.0±1.0 290±59颗粒 1.8 513±41* 6.8±1.9* 76.6±24.5* 6.6±1.2* 289±56*5.4 520±29** 6.8±1.3* 75.2±17.1** 6.5±1.5* 281±78*

表4 尿毒清颗粒对DN大鼠体重、肾脏重量、肾指数、红细胞和肾脏中山梨醇含量的影响(n=10，±s)

表4 尿毒清颗粒对DN大鼠体重、肾脏重量、肾指数、红细胞和肾脏中山梨醇含量的影响(n=10，±s)

注:*P ＜0.05，**P＜0.01，与模型组相比。

组别 剂量/(g/kg)肾脏重量/g 肾指数红细胞山梨醇含量/(μmol/L)肾匀浆山梨醇含量(μmol/L)Ccr/(mL/min/100 g )对照 － 2.02±0.13** 0.52±0.03** 4.85±1.37** 19.89±5.56* 0.298±0.118*模型 － 2.22±0.18 0.90±0.10 17.98±5.30 28.41±8.01 0.187±0.082尿毒清 0.6 2.16±0.25 0.81±0.15 10.36±2.58** 26.47±8.67 0.271±0.211颗粒 1.8 2.04±0.16* 0.71±0.11** 10.20±2.30** 25.71±7.71 0.374±0.179*5.4 2.07±0.12* 0.74±0.12** 5.99±1.94** 21.91±3.24* 0.428±0.240*

3.5 尿毒清颗粒对STZ－CFA诱导的DN大鼠肾脏病理及Ⅳ型胶原表达的影响 采用肾脏病变程度综合评分和IV型胶原表达作为药物干预DN病理学变化的评价指标。肾脏病理学研究表明，本研究成功地复制了DN模型。表现为(1)肾小球呈分叶状，系膜区增宽，基质增多，HE染色时呈深伊红染，PAS染色呈阳性反应。(2)肾小管病变表现为上皮细胞空泡变，PAS呈轻度阳性反应。(3)肾皮质、髓质交界处小血管管壁增厚，和/或伴有血管壁空泡变，符合DN的病理学特征，同时，肾脏Ⅳ型胶原表达明显增多。尿毒清颗粒1.8 g/kg、5.4 g/kg明显改善DN的病理学变化，减少Ⅳ型胶原表达量，而0.6 g/kg无明显改善作用(如图2和表5所示)。

表5 尿毒清颗粒对DN模型肾脏IV型胶原的表达和病理学评分的影响(n=10，±s)

表5 尿毒清颗粒对DN模型肾脏IV型胶原的表达和病理学评分的影响(n=10，±s)

注:*P ＜0.05，**P＜0.01，与模型组相比。

组别 剂量/(g/kg)/%对照 － 8.1±1.9** 0.3±0.5** 22.1±4.4 IV型胶原/%病理评分PAS染色评分**模型 － 21.7±2.9 3.4±1.3 36.2±3.6尿毒清 0.6 19.1±3.4 2.7±1.0 33.1±5.1颗粒 1.8 14.5±4.9** 1.8±1.3* 29.8±5.6**5.4 14.8±4.5** 1.6±1.1** 27.0±5.5**

图2 尿毒清颗粒对DN大鼠模型肾脏病理学及Ⅳ型胶原表达的影响

4 讨论

不论是DN还是其他类型的肾病，蛋白尿与肾病的进展密切相关。蛋白尿是肾小球血管内皮细胞损伤的标志，它反映了肾小球血管发生了早期硬化及慢性炎症病变，因而表现为白蛋白可以从血管渗漏［8］。蛋白尿和微白蛋白尿的出现对于患者来说意味着可能出现的严重后果甚至导致死亡。尿毒清颗粒可明显降低24 h总蛋白和白蛋白排出量，提高Ccr，而表现出改善DN的效应。

AGEs的聚积和多元醇通路的激活是糖尿病并发症的重要发病机制。抑制AGEs的生成、阻断其病理损害已经成为治疗DN药物研究的热门靶点［9］。山梨醇是多元醇通路的中间产物，检测组织中山梨醇的含量，能有效反应该组织中多元醇通路的激活状态。糖尿病状态下，山梨醇在细胞内不断聚集，NADPH量减少，导致细胞内渗透压增加，细胞水肿，肌醇、K+、氨基酸等消失，还原型谷胱甘肽减少，氧化应激增强，导致细胞结构损害，代谢与功能紊乱，产生组织细胞病变［10，11］。Oishi等日本学者发现，糖尿病视网膜病变患者红细胞内多元醇代谢产物山梨醇的浓度与糖尿病白内障并发症的病变程度正相关，提供了一个方便检测多元醇代谢的方法［12］。本实验采用荧光法测定动物血清AGEs的水平，微量酶促反应测定动物红细胞及肾组织内山梨醇水平，结果表明，尿毒清颗粒减少 DN大鼠AGEs在体内的聚积，抑制多元醇通路的激活，这有可能是其改善DN的上游因素。

氧化应激是糖尿病并发症的发病机制的核心环节。它激活了几乎所有的糖尿病并发症有关的病理通路。更为严重的是，伴随着过氧化产物的堆积，同时产生了大量的强氧化剂－氧化一氮(nitric oxide)，后者又激活了腺苷二磷酸核糖聚合酶，损伤血管内皮细胞功能，激发了血管炎症，进一步加重了糖尿病并发症的病理演变。抗氧化治疗已经受到了糖尿病学者们密切注意，启动了药物研究计划［13］。本研究测定了与氧化应激相关的指标，结果表明，尿毒清颗粒能够改善DN大鼠氧化还原失衡状态。如前所述，AGEs的聚积和多元醇通路激活可引起活性氧簇的过多产生，而尿毒清颗粒对这两条通路的抑制作用也是其产生抗氧化作用的重要机制。

DN以肾小球和小管上皮细胞的过度肥大、肾小球和小管基底膜增厚、胞外基质蛋白聚集为特征。胞外基质的调节是一个动态的过程，包括合成和降解，这个过程的不平衡会导致基质的聚集乃至渐进的肾小球硬化。胞外基质是由几种蛋白成分构成的，IV型胶原是其主要结构成分之一，DN时IV型胶原表达增多。本文以HE和PAS两种染色方法观察了肾小球的病理变化，免疫组织化学的方法观察肾小球IV型胶原的表达量，结果表明尿毒清颗粒可降低PAS染色评分及病理学评分，改善模型动物肾脏基质增生、系膜区增大的病变情况，减少肾小球Collagen IV的表达。

综上所述，尿毒清颗粒明显改善DN模型的肾脏功能，主要表现为减少尿液中白蛋白的排出，提高肌苷清除率，减轻肾脏病理学改变，这与其抑制AGEs聚积和山梨醇通路的激活，纠正机体的氧化还原失衡，抑制IV型胶原的表达的作用有关。

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