壳聚糖微球作为鼻黏膜免疫载体的研究进展*

黏膜免疫是动物机体防御传染病的第一道屏障,而鼻黏膜是许多病原微生物进入机体的必经之路。鼻黏膜免疫与局部或全身性免疫相比,有许多优点,例如鼻黏膜免疫无刺激、无痛感、为非侵入性,且不需要严格的无菌处理。鼻腔内大量的微绒毛构成鼻黏膜较大的表面积,多孔的内皮组织及高度血管化的上皮组织可以起到很好的递呈作用。尽管鼻黏膜免疫有明显的优势,但是疫苗在鼻腔内的低渗透性和短暂的停留时间,严重阻碍了鼻黏膜的递呈。而有效的鼻黏膜载体可以提高其抗原的免疫原性,并对处于该环境中的抗原起到保护作用〔1〕。

壳聚糖微球作为鼻黏膜药物递呈系统的载体,已经在许多疫苗中被广泛深入的研究,如蛋白质、多肽及核酸疫苗。为了提高药物的生物利用度及细胞膜的通透性,或提高实现持久释放药物的能力,壳聚糖微球首先被醇化,再与透明质酸及普郎尼克F127形成复合物来发挥作用〔2〕。

1 鼻黏膜免疫

1.1 鼻黏膜免疫的优点 黏膜表面是机体防御感染的第一道防线,大多数病原体都是通过胃肠道黏膜、呼吸道黏膜及生殖道黏膜引起宿主感染,可以把黏膜作为理想的疫苗接种位点。一些研究表明,对于相同的疫苗免疫途径来说,鼻黏膜免疫比口服免疫更有效,尤其对于啮齿类动物的免疫。

鼻黏膜表面上皮细胞上的微绒毛,提供了很大的膜表面积,能提高鼻黏膜的吸收效率。由鼻腔递呈途径免疫,药物及疫苗可直接在黏膜表面被吸收,从而避免了经胃肠道免疫所造成的破坏。此外,鼻腔中酶活性相对较低,对疫苗免疫的需求量相对较少,并且可以保护疫苗不受酶的降解。Arora等〔4〕报道,与口服免疫相比,抗原经鼻黏膜免疫的剂量为口服免疫剂量的四分之一,但仍可在血清及黏液中诱导强有力的抗原特异性抗体反应。鼻黏膜富含脉管系统及高通透性的结构,使之能通过鼻黏膜上皮细胞吸收药物。因此,可以通过控制药物的逐渐释放来达到治疗的目的。

鼻黏膜疫苗免疫,不仅可以诱导产生全身性IgG抗体反应,还可以产生黏膜IgA抗体反应,最终形成两道防御体系来共同保护机体免受传染性疾病病原的侵害〔2〕。鼻腔中含有丰富的树突状细胞,可以介导强大的全身性及黏膜免疫反应,可以防御各种抗原及病原体通过呼吸系统对机体的侵害。

鼻黏膜免疫,由于抗原特异性淋巴细胞分布在机体共同黏膜免疫体系中,所以,可以在远距离的黏膜位点诱导特异性的IgA抗体的免疫反应,包括上呼吸道、下呼吸道和肠道黏膜,以及鼻咽、唾液腺、生殖道及扁桃体〔2〕。有研究显示,鼻黏膜免疫可在唾液腺及生殖道中产生抗原特异性免疫反应。结果发现,刺激后的淋巴细胞迁移到了共同黏膜免疫系统的特异性效应因子位点,这与黏膜特异性淋巴细胞归巢理论一致。

1.2 鼻黏膜免疫的缺点 尽管疫苗通过鼻黏膜免疫有许多优点,但是由于具有一些局限性,从而阻碍了鼻黏膜疫苗的发展。鼻黏膜免疫最重要的局限性之一是存在于黏膜表面的黏膜纤毛对疫苗制剂的快速清除作用。物质在进入鼻腔的21 min内,会被鼻黏膜上的黏膜纤毛清除,已报道的人类鼻黏膜的清除时间是12～15min〔5〕。因此,降低黏膜纤毛的清除速率,可以延长抗原与鼻黏膜的接触时间,从而增强药物的透过性,提高疫苗的免疫效果。

鼻黏膜免疫另一个重要的局限性是鼻腔中所含酶类对侵入物质的降解作用,将阻碍药物的通透性及黏膜的吸收。这是由于细胞色素酶、非氧化性脱氨酶、蛋白水解酶等一些代谢酶的作用而导致。已报道的鼻黏膜上的蛋白水解酶,可以降低对其药物中缩氨酸的吸收。值得注意的是,鼻黏膜上的氨肽酶可对生物药剂中的蛋白质及多肽进行降解〔6〕。有报道显示,鼻腔中的P-450依赖性单氧酶系统可以代谢酒精、尼古丁、,可卡因等化合物。因此,一些治疗药物,包括鼻黏膜途径递呈的疫苗,往往都受限于鼻腔中的酶促降解作用〔6〕。

不含任何黏膜保护剂的疫苗在鼻黏膜免疫时,可能会诱发如贝尔氏麻痹综合症等一些严重的临床症状。Mutsch等〔7〕报道,2000-2001年期间用于瑞士的灭活流感疫苗,由于未加黏膜保护剂,在鼻黏膜接种后,其接种者患贝尔氏麻痹综合症的风险显著增高。同时,鼻黏膜免疫过程中,还要涉及鼻腔内环境对抗原的影响,这包括黏膜分泌物对其的稀释作用,可溶性抗原未被摄取以及上皮细胞对其的排斥等,尤其是含量低的可溶性非粘附性抗原,只能诱导低水平的免疫应答。因此,新型鼻黏膜疫苗的开发,主要通过鼻黏膜表面抗原递呈系统的改进来实现。

2 壳聚糖微球

2.1 壳聚糖微球的理化特性 壳聚糖由于其无毒、具有生物相容性、可降解性、独特的黏膜黏附性和高渗透性,已成为最有应用前景的聚合物之一。壳聚糖强有力的黏膜粘附性使之成为黏膜免疫途径中最重要的药物递呈载体。此外,带正电荷的壳聚糖与带负电荷的黏液层之间因相互作用而紧密连接,使密接结合的黏膜层暂时打开,便于亲水性高分子物质的运输。壳聚糖强有力的黏膜粘附性还可以在药物的递呈过程中,提高药物递呈的通透性。鼻腔及口服药物递呈途径的研究表明,与壳聚糖结合的大量高分子聚合物可通过黏膜屏障被吸收。壳聚糖的促吸收作用是由于它可以在疫苗制剂及鼻黏膜组织之间产生瞬时的旁通路效应。Jeong等〔8〕报道,壳聚糖在改变旁通路运输中具有重要作用。

一些研究显示,壳聚糖可在黏膜免疫中起到佐剂的作用。加入壳聚糖后进行鼻黏膜免疫的百日咳杆菌血凝素及其重组体毒素可以诱导强大的抗原特异性全身及黏膜免疫应答,混合壳聚糖的白喉毒素鼻黏膜免疫,可诱导全身及局部的免疫反应。也有一些研究表明,加入壳聚糖后黏膜接种,不但可以诱导体液免疫应答,还可以诱导细胞介导的免疫应答。Xie等〔9〕研究发现,壳聚糖作为免疫佐剂,可同时产生辅助性T细胞1(Th1)型和2(Th2)型免疫反应。混合壳聚糖的白喉疫苗经鼻黏膜免疫,可以产生混合型Th1/Th2免疫反应,表明该疫苗可同时诱导体液及细胞免疫应答。壳聚糖也具有免疫刺激活性,它可以激活巨噬细胞,促进细胞因子的产生及增强细胞毒性T淋巴细胞的反应。

高分子黏膜粘着剂的应用,可降低黏膜纤毛对侵入物的清除作用。一些研究显示,壳聚糖可以延长鼻黏膜递呈过程中药物在吸收部位的停留时间。

2.2 黏膜载体颗粒 颗粒载体技术为疫苗递呈系统的发展提供了一些有价值的参考。到目前为止,引入疫苗递呈系统的载体主要有纳米微球、感光乳剂、脂质体、人工构建的病毒亚载体、免疫刺激复合物、病毒样颗粒等。这些微粒是疫苗递呈系统的重要组成部分,他们可以刺激宿主的免疫系统,引起免疫应答。

首先,大多数载体颗粒以最适粒度通过黏膜系统进入机体被抗原递呈细胞识别,这样疫苗制剂就很容易被运输穿过细胞膜。由于较小的颗粒(＜10 μ m)比较大的颗粒(＞10 μ m)具有更好的免疫原性,因此,颗粒大小的参数设定对提高其免疫原性非常重要。其次,与一些液体佐剂相比,载体颗粒可以延长疫苗在黏膜表面的停留时间。有报道称,载体颗粒可以在鼻黏膜免疫中发挥直接作用,它可以引起黏膜上皮细胞脱水,使紧密连接的细胞分离。Kunisawa等〔10〕报道,载体颗粒与疫苗混合的优点在于,可延长疫苗的停留时间,以提高疫苗在黏膜表面的生物利用度及促进黏膜对其的吸收。Ahire等〔3〕研究显示,壳聚糖微球包裹破伤风毒素口服免疫,在肠粘膜的洗涤液中可检测出抗原特异性IgA,并且在外周血中也含有大量的抗原特异性IgG。

2.3 壳聚糖微球在鼻黏膜免疫中的作用 壳聚糖可以被制成不同的形态,如微球、纳米球、薄膜及条状颗粒。许多研究报道,壳聚糖微球主要作为鼻黏膜疫苗免疫的载体。有报道显示,壳聚糖微球与白喉毒素混合鼻黏膜免疫,可以提高抗原特异性IgG的产生。Alpar等〔11〕实验证明,加入壳聚糖微球后的牛血清白蛋白(BSA)与不加壳聚糖相比,能诱导更多的抗原特异性 IgG 抗体反应。Kang等〔12〕发现,壳聚糖微球包裹的支气管败血波士杆菌抗原经鼻黏膜免疫,免疫小鼠的鼻洗液中抗原特异性IgA滴度能显著升高。此外,鼻洗液及唾液中IgA滴度可随时间的延长而升高。

为了研制出更加有效的黏膜免疫疫苗,一些科学家研究了疫苗递呈系统与黏膜佐剂的协同效应。Baudner等〔13〕人在研究中发现,重组大肠杆菌不耐热毒素与壳聚糖微球按比例混合后鼻黏膜免疫小鼠,可以在血清中产生更高水平的抗原特异性IgG抗体,同时在鼻洗液中产生高水平的抗原特异性IgA。研究者同时还研究另一种N-三甲基壳聚糖微球,它与相关抗原混合,也可以诱导鼻洗液,阴道洗液及血清中高滴度的抗原特异性抗体。

特异性M细胞及黏膜相关淋巴组织(MALT)对颗粒性抗原载体的识别,是黏膜接种诱导效应性免疫反应的关键。Lim等〔14〕报道,壳聚糖微球包裹的质粒DNA纳米粒子在MALT上被M细胞识别,并被递呈到下一级的淋巴组织中。Khatri等〔15〕通过激光扫描电镜观察,荧光标记的卵白蛋白口服免疫后,壳聚糖可以提高淋巴结上皮细胞对其的摄取,随后,被摄取的壳聚糖微球包裹的卵白蛋白可以通过免疫组化着色做进一步的观察。

Khatri等〔16〕研究发现,Th1介导免疫反应所产生的细胞因子可以清除病原体对宿主的感染,壳聚糖纳米粒子包裹的质粒DNA鼻黏膜免疫小鼠后,可提高IL-2和 IFN-γ的水平。Kumar等〔16〕报道,壳聚糖-DNA纳米粒子鼻黏膜接种,可诱导细胞毒性T细胞(CT L)的免疫反应,并产生IFN-γ及特异性的IgA和IgG抗体。T h1依赖性细胞因子及CTL免疫反应的研究,证实了壳聚糖微球参与的鼻黏膜免疫,可以介导强大的细胞免疫应答。

2.4 甘露糖基化壳聚糖微球的鼻黏膜免疫 甘露糖受体主要存在于巨噬细胞和树突状细胞上,它在先天性及适应性免疫中具有重要作用。抗原的甘露糖基化是一个很具吸引力的研究,它可以通过与抗原递呈细胞(APC)上的甘露糖受体位点结合来提高抗原的免疫原性。由于膜结合C型凝集素受体如巨噬细胞甘露糖受体(MMR)、树突状细胞内粘附分子(DC-ICAM)及胰岛蛋白可被细胞质内吞形成网络蛋白包裹的囊泡,所以甘露糖基化的抗原可以被此类细胞表达的受体所识别、吞噬、并释放到早期核内体的酸性内环境中。此外,巨噬细胞甘露糖受体可识别含甘露糖残基的抗原,并导入早期的核内体中,树突状细胞内粘附分子会直接将抗原导入成熟的溶酶体中进行降解,之后,巨噬细胞甘露糖受体再返回到细胞表面,把之后的外源性抗原递呈给II类主要组织相容性复合体(MHC-II)分子。

甘露糖基化的抗原可以显著提高对T细胞的刺激能力。Mitchell等〔17〕实验证实,被甘露糖受体识别的抗原,对T细胞的刺激能力可增强100倍。此外,甘露糖基化的药物递呈系统如甘露糖基化脂质体及类脂质体,可以通过与抗原递呈细胞上的甘露糖受体结合,来增强其抗原的免疫原性。

甘露糖基化的壳聚糖或壳聚糖微球在一些研究中被用来评价所介导的基因递呈系统。Hashimoto等〔18〕研究显示,甘露糖基化的壳聚糖是有效的基因递呈系统,它具有高的转染率及低的巨噬细胞毒性。甘露糖基化的壳聚糖被证明能有效的将IL-2基因递呈给树突状细胞,从而增强抗肿瘤性免疫反应。Kim等〔19〕实验表明,甘露糖基化的壳聚糖微球与DNA混合,可以有效的增强血清抗体水平及CTL反应。

在一些研究中,甘露糖基化的壳聚糖微球作为鼻黏膜疫苗免疫的载体来诱导受体介导的胞吞作用。甘露糖基化的壳聚糖微球(MCMs)是通过与三聚磷酸盐的凝胶化方法来制备的。Porporatto等〔20〕研究显示,壳聚糖可增强巨噬细胞的功能,并诱导细胞因子的产生及I类和II类主要组织相容性复合体的活化。因此,甘露糖基化的壳聚糖微球的应用可增强机体的免疫应答。

3 结 语

综上所述,壳聚糖微球可以作为有效的鼻黏膜免疫载体。不同方法制备的壳聚糖微球作为递呈工具用于鼻黏膜免疫,可以用于评价药物的控释能力、疫苗的保护性及抗原在黏膜表面的通透性。壳聚糖微球在鼻黏膜免疫中可增强其抗原的免疫原性,通过对壳聚糖微球的化学修饰,达到与抗原在免疫应答中的协同效应,或通过壳聚糖的甘露糖基化,来诱导受体介导的抗原递呈细胞的递呈作用。被壳聚糖微球包裹的抗原,经鼻黏膜免疫接种动物模型后,可诱导抗原特异性的鼻黏膜免疫应答及全身性的免疫应答。因此,壳聚糖微球作为鼻黏膜免疫的载体,具有其自身的研究价值和广阔的应用前景。

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