α－突触核蛋白的生物学功能及其在帕金森病中的作用*

熊中奎， 胡雅儿

(1绍兴文理学院医学院临床医学部，浙江 绍兴 223000;2上海交通大学医学院细胞调控实验室，上海 200025)

α－突触核蛋白(α－synuclein)是一种脑内含量丰富的神经蛋白，既参与正常突触功能的维持，又与各种神经退行性疾病有关。在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)患者脑内，α－突触核蛋白是多巴胺神经元中嗜伊红染色Lewy小体主要成分。α－突触核蛋白基因位于染色体4q21.3－q22，均由5个外显子构成。α－突触核蛋白由140个氨基酸残基构成，分子量约19 kD。根据估算，α－突触核蛋白占脑匀浆蛋白含量的1%，在端脑中含量丰富。最初研究认为α－突触核蛋白与核膜之间存在关联性，而后来的研究发现它可通过经典分泌通路被分布于各种质膜上。α－突触核蛋白分子在自然状态下呈伸展状，其保守的赖氨酸和谷氨酸残基与两性端部基团(headgroup)相互作用，而中性基团插入到酰基链区域，使之在质膜上呈疏松的卷曲α－螺旋结构，伸展并平行于质膜的曲面［1］。

1 生物学功能

到目前为止，还没有全面地认识α－突触核蛋白的生物学功能，但是现有资料至少表明α－突触核蛋白具有以下几种功能:(1)调节突触的可塑性。Golovko等［2］研究发现α－突触核蛋白在斑胸草雀(zebra finch)学习唱歌的阶段表达上调，而且主要定位于突触前神经末梢，故推测在突触可塑性和功能方面发挥重要作用。在体外培养胚胎大鼠海马神经元中，突触蛋白I(synapsin I)在体外培养的第1 d即可检测到表达，而α－突触核蛋白直至培养约5 d时仍然未检测到，因此认为它可能与突触的后期发育及调节有关。(2)整合突触前信号。通过其脂质结合特性和增强磷脂酶D的活性促进突触囊泡的形成，α－突触核蛋白调节突触前神经末梢跨膜转运。(3)调节突触处的多巴胺含量。α－突触核蛋白抑制儿茶酚胺合成限速酶酪－氨酸羟化酶活性。在突触末端囊泡单胺转运体－2迅速而有效地转运多巴胺，α－突触核蛋白调节多巴胺转运体在细胞膜上穿梭影响多巴胺在神经末梢摄取的效率。⑷调节小胶质细胞活性。α－突触核蛋白敲除小胶质细胞再受到刺激后，与对照组比较，前炎症因子肿瘤坏死因子－α和白细胞介素－6的分泌水平提高。⑸热休克蛋白样作用。α－突触核蛋白的C－端区域与小热休克蛋白如α－晶体蛋白相似，能够保护细胞内的蛋白免于变性。α－突触核蛋白保护细胞免于温度和氧化应激的影响，其C－端删除导致它对细胞内蛋白对抗温度应激的保护作用减弱。研究发现α－突触核蛋白的缺失导致Parkin基因敲除所产生的损伤效应恶化;另一方面，恢复正常的α－突触核蛋白水平可缓解Parkin丢失所致的神经毒性。⑹参与脂代谢调节。α－突触核蛋白敲除小鼠的脂肪酸摄取、转移、代谢过程被干扰，推测其参与细胞内脂肪酸的代谢，而且α－突触核蛋白影响星形胶质细胞中脂肪酸的摄取和转运。

2 α－突触核蛋白与帕金森病

早在1996年意大利的PD家系中首先发现了α－突触核蛋白点突变A53T，以后又发现了A30P和E46K。点突变增加其聚合度，二倍体和三倍体提高表达水平。果蝇转基因突变模型进一步证实了α－突触核蛋白基因突变与PD的关系，α－突触核蛋白基因突变型果蝇成年后出现多巴胺能神经元减少，形成含α－突触核蛋白的包涵体并表现出运动功能障碍。然而与点突变比较，α－突触核蛋白基因重排在常染色体显性遗传性PD中出现的频率更高［3］。在散发型PD的研究中未发现基因突变，α－突触核蛋白基因多态性，如启动子区，特别是Rep1多态性重复序列等位基因以及3’－末端多态性与散发性PD的寿命期有关。

2.1 影响病理性α－突触核蛋白构型水平的因素研究发现α－突触核蛋白的多种结构形式如无定型聚集物、寡聚体、原纤维和纤维及其磷酸化、硝基化和泛素化均有神经毒性。其中，α－突触核蛋白纤维由5个β－折叠构成，每个原纤维2 nm×3.5 nm，β1→β5两两之间一次发生相互作用［4］。α－突触核蛋白正常、错误折叠及其寡聚化之间存在动态平衡，当这种平衡被打破后原纤维迅速聚集成大分子、不溶性细纤维进而形成Lewy小体，以避免神经元受到更大的损害。然而这种保护作用是短暂的，α－突触核蛋白的病理性积聚最终导致细胞的凋亡或死亡。

①基因突变。在一项离体实验中，将野生型、A53T和A30P突变型人α－突触核蛋白基因导入细菌。野生型和突变型α－突触核蛋白在体外培养时都可以形成具有反向平行β－折叠的不溶性原纤维，其中突变型尤其是A53T突变型显著加快纤维蛋白聚集物的形成。

②分子伴侣功能异常。分子伴侣的作用是保证蛋白质的正确折叠与组装。目前发现的大多数分子伴侣都属于热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)家族，如HSP70、HSP40等。在HSP70和α－突触核蛋白的转基因果蝇模型中发现虽然对α－突触核蛋白的包涵体模型无影响，但可明显缓解多巴胺神经元的丢失，而在细胞模型中HSP70的高表达可减少α－突触核蛋白聚集物的形成。

③泛素蛋白酶体系统的缺陷。体内大多数错误折叠、未装配以及损伤的蛋白质的是在泛素标记并被特异性识别后，由泛素蛋白酶体系统降解清除。在PD家族中发现泛素羧基端水解酶基因突变造成酶活性下降，出现典型的PD症状。当α－突触核蛋白原纤维的浓度超过26S蛋白酶体的5倍，则可显著抑制无定形蛋白的非泛素依赖蛋白酶体降解和折叠蛋白的泛素依赖降解。α－突触核蛋白是蛋白酶体的底物，抑制蛋白酶体的活性则进一步引起α－突触核蛋白的积累和聚集，最终形成一个恶性循环［5］。④翻译后修饰。1)磷酸化修饰。α－突触核蛋白第129位丝氨酸磷酸化 (pS129)是PD的一个重要特征［6］。体外实验发现pS129后比未磷酸化者能够产生更多寡聚体和不溶性成分。该磷酸化主要由polo样激酶－2(polo－like kinase－2，PLK2)和PLK3完成的，磷酸化率大于95%，底物识别是通过N－末端重复序列和(或)NAC区［25］。第一、在哺乳动物细胞系、原代神经元和α－突触核蛋白转基因小鼠的各种亚细胞部分，如细胞质、细胞核和细胞膜中均发现PLKs特异性与pS129共存。第二、PLK2在阿尔采末病患者和Lewy体患者表达水平显著增加。氧化应激和蛋白酶体抑制引起pS129水平增加［7］。而α－突触核蛋白第125位丝氨酸磷酸化可抑制其寡聚体的形成［8］。2)泛素化修饰。在多巴胺神经元中泛素－蛋白异构肽连接酶(ubiquitin－protein isopeptide ligase)seven in absentia homolog(SIAH)催化 α －突触核蛋白的单泛素化修饰促进其聚集［9］。SIAH催化α－突触核蛋白单泛素化位点有第10、12、21、23、34、43和96位丝氨酸残基。电镜下观察到单泛素化α－突触核蛋白大量非晶体状聚集，在体内单泛素化增加α－突触核蛋白包涵体的形成。synphilin－1A抑制SIAH来调控α－突触核蛋白的单泛素化及包涵体的形成［10］。3)硝基化和氧化修饰。硝基化和氧化α－突触核蛋白在包涵体中被检测到。胞质DA尤其是其氧化代谢产物，与α－突触核蛋白发生相互作用，使α－突触核蛋白形成错误折叠构型，如α－突触核蛋白蛋氨酸残基氧化产生二硫键导致可溶性寡聚体形成［11］。在PD患者的包涵体内发现大量硝基化α－突触核蛋白。氧化应激状态下，α－突触核蛋白第125位酪氨酸残基是硝基化的特异性靶点。硝基化破坏了α－突触核蛋白正常构象，引起蛋白质异常集聚。实验研究发现小胶质细胞激活释放的一氧化氮和过氧化物是PD病变中异常的硝基化和氧化α－突触核蛋白产生的原因［12］。

2.2 病理性α－突触核蛋白在PD发病机制中的作用

①干扰脂质双分子层并使之通透性增加，影响突触囊泡完整性以及胞质DA水平。突变型(A30P或A53T)α－突触核蛋白均可干扰囊泡pH，显著增加胞质中儿茶酚胺，使胞内氧化还原损伤趋于恶化。研究发现A30P、A53T突变以及变异型原纤维α－突触核蛋白都比野生型对突触囊泡通透性具有更强的影响。原纤维α－突触核蛋白诱导的通透性表现出囊泡中低分子量物质优先漏出的特点，这表明可能是一种微孔样通透机制。当囊泡膜稳定性较差如Ca2+缺乏时，这种通透性对漏出的物质更加缺乏分子量上的选择性，而且单分子态α－突触核蛋白即可通过洗涤剂样作用机制诱导囊泡膜的通透性增强。Danzer等［13］发现某些寡聚体诱导细胞死亡通过微孔形成机制破坏胞内离子平衡，如诱导钙内流，还有部分寡聚体通过直接进入胞内引起α－突触核蛋白积聚增加。Guo等［14］证实上调α－突触核蛋白表达可抑制VMAT－2的活力，进一步干扰DA的代谢并导致DA神经元的损伤。

②影响胞内物质运输功能。第一，影响内质网→高尔基体的囊泡运输。表达α－突触核蛋白的酵母菌中出现最早的缺陷是从内质网到高尔基体囊泡运输被阻断。过表达α－突触核蛋白抑制内质网→高尔基体囊泡运输，囊泡以出芽方式顺利从内质网出来，但是随后在特定部位停留并与高尔基体膜融合时被抑制，定位于高尔基体后囊泡的RAB8A和定位于神经末梢的RAB3A缓解过表达α－突触核蛋白所致的神经毒性［15］。第二，影响轴浆运输。研究发现将α－突触核蛋白的A30P或A53T点突变基因转染到体外培养神经元上，神经元表现出轴浆运输减弱，而且发现转染A30P的神经元α－突触核蛋白易于集聚到胞体。而轴浆运输的减弱可能促进了α－突触核蛋白的核周集聚、Lewy小体形成和神经元的异常改变。Chung等［16］发现在AAV－α－突触核蛋白大鼠病理模型纹状体和黑质中，发生神经元丢失之前突触传递和轴浆运输相关蛋白发生明显变化。纹状体rabphilin 3A和syntaxin减少。纹状体内顺向运输动力蛋白(KIF1A、KIF1B、KIF2A、KIF3A)降低，而逆向运输动力蛋白(dynein、dynamitin、dynactin 1)增加。黑质内HIF1和AHIF2A增加。细胞骨架蛋白发生急剧改变，actin水平增加而α－微管蛋白和γ－微管蛋白水平降低。

③导致蛋白酶体降解抵抗。过表达血红素加氧酶－1(heme oxygenase－1，HO－1)可剂量依赖性减少神经母细胞瘤M17细胞中α－突触核蛋白水平并减少其聚集，而不能显著影响A30P突变型α－突触核蛋白。当神经元暴露于诱导蛋白错误折叠的有害刺激下，HO－1触发蛋白酶体降解通路，防止胞内蛋白聚集及包涵体形成;然而A30P突变型α－突触核蛋白PD患者表现出对HO－1诱导蛋白酶体降解的抵抗［17］。

④影响吞噬功能。有研究发现，表达A53T点突变，甚至某些情况下野生型α－突触核蛋白的神经元表现出分子伴侣介导自体吞噬(chaperone mediated autophagy，CMA)功能障碍，后者引起代偿性巨型自体吞噬(macroautophagy)，而巨型自体吞噬作为一种损害性反应导致神经元的死亡［18］。

⑤神经炎症反应。硝基化α－突触核蛋白通过CD4+细胞亚群诱导小胶质细胞炎症反应［19］。Chung等［16］发现在AAV－α－突触核蛋白大鼠病理模型纹状体和黑质中，出现神经炎症反应，Iba－1激活小胶质细胞和前炎症细胞因子IL－1β、IFN－γ和TNF－α水平增加。

⑥影响组蛋白乙酰化。体外实验中A30P和A53T突变增加α－突触核蛋白进入细胞核的比例。进入细胞核的α－突触核蛋白产生毒性，而保留在细胞质中的α－突触核蛋白具有保护作用。α－突触核蛋白的毒性通过给予组蛋白去乙酰化酶抑制剂解除。α－突触核蛋白直接结合到组蛋白上，降低乙酰化组蛋白H3水平并抑制乙酰化作用。

⑦tau蛋白过度磷酸化。研究发现12个月龄A53T突变型转基因小鼠的突触部位发现tau蛋白第396位丝氨酸异常磷酸化，α－突触核蛋白激活糖原合成酶激酶 －3β(glycogen synthase kinase－3β，GSK －3β)，后者催化 tau 蛋白的过度磷酸化［20］。

事实上，许多具有重要生理功能的蛋白质在特定条件下也会表现出毒性作用。一般认为超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)对氧化应激具有保护作用，然而SOD的过度表达也可产生神经损伤，这一点体现在肌萎缩脊髓侧索硬化症上。迄今α－突触核蛋白的功能还未完全了解，但是很多证据表明正常α－突触核蛋白在细胞内具有多种重要生物学功能，而过度表达、异常修饰或者突变α－突触核蛋白会对细胞产生显著病理性损伤作用［21］。

［1］Jao CC，Hegde BG，Chen J，et al.Structure of membrane－bound alpha－synuclein from site－directed spin labeling and computational refinement［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(50):19666－19671.

［2］Golovko MY，Barceló－ Coblijn G，Castagnet PI，et al.The role of alpha－synuclein in brain lipid metabolism:a downstream impact on brain inflammatory response［J］.Mol Cell Biochem，2008，326(1－2):55－66.

［3］Ibanez P，Lesage S，Janin S，et al.Alpha－ synuclein gene rearrangements in dominantly inherited parkinsonism:frequency，phenotype，and mechanisms［J］.Arch Neurol，2009，66(1):102 －108.

［4］Vilar M，Chou HT，Lührs T，et al.The fold of alphasynuclein fibrils［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(25):8637－8642.

［5］Zhang NY，Tang Z，Liu CW.Alpha－synuclein protofibrils inhibit 26 S proteasome－mediated protein degradation:understanding the cytotoxicity of protein protofibrils in neurodegenerative disease pathogenesis［J］.J Biol Chem，2008，283(29):20288－20298.

［6］Mbefo MK，Paleologou KE，Boucharaba A，et al.Phosphorylation of synucleins by members of the polo－like kinase family［J］.J Biol Chem，2010，285(4):2807 －2822.

［7］Chau KY，Ching HL，Schapira AH，et al.Relationship between alpha synuclein phosphorylation，proteasomal inhibition and cell death:relevance to Parkinson’s disease pathogenesis［J］.J Neurochem，2009，110(3):1005 －1013.

［8］Chen L，Periquet M，Wang X，et al.Tyrosine and serine phosphorylation of alpha－synuclein have opposing effects on neurotoxicity and soluble oligomer formation［J］.J Clin Invest，2009，119(11):3257 －3265.

［9］Rott R，Szargel R，Haskin J.Monoubiquitylation of alpha－synuclein by seven in absentia homolog(SIAH)promotes its aggregation in dopaminergic cells［J］.J BiolChem，2008，283(6):3316－3328.

［10］Szargel R，Rott R，Eyal A，et al.Synphilin－1A inhibits seven in absentia homolog(SIAH)and modulates alphasynuclein monoubiquitylation and inclusion formation［J］.J Biol Chem，2009，284(17):11706－11716.

［11］Leong SL，Pham CL，Galatis D，et al.Formation of dopamine－mediated alpha－synuclein－soluble oligomers requires methionine oxidation［J］.Free Radic Biol Med，2009，46(10):1328－1337.

［12］Gao HM，Kotzbauer PT，Uryu K，et al.Neuroinflammation and oxidation/nitration of alpha－synuclein linked to dopaminergic neurodegeneration［J］.J Neurosci，2008，28(30):7687－7698.

［13］Danzer KM，Haasen D，Karow AR，et al.Different species of alpha－synuclein oligomers induce calcium influx and seeding［J］.J Neurosci，2007，27(34):9220 －9232.

［14］Guo JT，Chen AQ，Kong Q，et al.Inhibition of vesicular monoamine transporter－2 activity in alpha－synuclein stably transfected SH －SY5Y cells［J］.Cell Mol Neurobiol，2008，28(35－47):35－47.

［15］Gitler AD，Bevis BJ，Shorter J，et al.The Parkinson’s disease protein alpha－synuclein disrupts cellular Rab homeostasis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(1):145－150.

［16］Chung CY，Koprich JB，Siddiqi H，et al.Dynamic changes in presynaptic and axonal transport proteins combined with striatal neuroinflammation precede dopaminergic neuronal loss in a rat model of AAV alpha－synucleinopathy［J］.J Neurosci，2009，29(11):3365 －3373.

［17］Song W，Patel A，Qureshi HY，et al.The Parkinson disease－associated A30P mutation stabilizes alpha－synuclein against proteasomal degradation triggered by heme oxygenase－1 over－expression in human neuroblastoma cells［J］.J Neurochem，2009，110(2):719 －733.

［18］Xilouri M，Vogiatzi T，Vekrellis K，et al.Abberant alpha－synuclein confers toxicity to neurons in part through inhibition of chaperone － mediated autophagy［J］.PLoS One，2009，4(5):e5515.

［19］Reynolds AD，Stone DK，Mosley RL，et al.Nitrated{alpha}－synuclein－induced alterations in microglial immunity are regulated by CD4+T cell subsets［J］.J Immunol，2009，182(7):4137－4149.

［20］Duka T，Duka V，Joyce JN，et al.Alpha － Synuclein contributes to GSK－3 beta－catalyzed Tau phosphorylation in Parkinson’s disease models［J］.FASEB J，2009，23(9):2820－2830.

［21］陶思祥，张国华，徐 杰，等.利福平对鱼藤酮处理的大鼠多巴胺神经元的保护作用［J］.中国病理生理杂志，2008，24(9):1751－1756.