CD69在细胞活化、凋亡中的双向免疫调节作用*

吴丹丹， 汪慧英

(浙江大学医学院附属第二医院1感染性疾病科，2变态反应科，杭州 浙江 310009)

分化抗原簇 69(cluster of differentiation 69，CD69)于1981年发现，早期被称为活化诱导分子(activation inducer molecule，AIM)，早期活化抗原－1(early activation antigen－l，EA －1)等，是 C － 型凝集素受体家族的成员，CD69基因属于自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)信号转导基因复合体家族，在细胞的生物功能调节中起着重要的信号转导作用。初始的研究证实CD69在细胞的活化中起着重要的促进作用。近年来的研究显示，CD69的表达在促进细胞进一步活化的同时，还可能与细胞的凋亡密切相关［1］。本文就CD69在细胞活化和凋亡过程中的这一双向免疫调节作用进行综述。

1 CD69的分子结构和基因定位

对CD69的分子结构研究显示:CD69是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，由199个氨基酸组成，包括40个残基的细胞内区，21个残基的跨膜区和138个残基的细胞外区。细胞外区有特征性的Ca2+依耐性糖基识别区域。CD69通常以同源二聚体形式存在，由分子量为28 kD和32 kD的2条链经二硫键连接，这2条链由分子量为22.5 kD的多肽链通过不同的糖基化组成。每条链细胞外区有1个位于第166个氨基酸位置的N端连接的糖基化位点，提示糖基化链的遗传异质性，但此遗传异质性的结构和功能的重要意义尚不清楚。CD69在细胞表面表达均为磷酸化形式［2］，这对它与其它细胞表面的蛋白分子连接很重要。CD69在细胞的生物功能中起着重要的信号转导作用。

小鼠与人的CD69有58%的同源性，也是由199个氨基酸组成的蛋白质。不同的是鼠的CD69有3个N端连接的糖基化位点，其中的一个与人的高度同源。CD69基因属于NK细胞信号转导基因复合体家族，人的CD69基因与NKG2基因丛相近，而后者在NK细胞的信号转导和靶向识别中有重要作用。不同的是，自然杀细胞受体蛋白1(natural killer cell receptor protein 1，NKP－P1)、NK细胞的抑制性受体Ly49与NK细胞活化性受体NKG2分子只表达在NK细胞上，而CD69可在多种细胞上表达。说明CD69有不同于这三者的特性。人的CD69基因位于12号染色体的短臂12p12.3－p13.2区，鼠的CD69基因位于6号染色体长臂的远端。小鼠的CD69基因结构已经确定，该基因由5个跨越7.5 kb的外显子组成，第1、2外显子分别编码细胞浆和跨膜区，第3－5外显子编码CRD。

2 CD69在细胞活化中的作用

CD69自被发现后，其初始研究基本上是关于它在细胞活化中的作用。CD69可在几乎所有髓系细胞中表达。但除了在血小板和单核细胞中有持续的低水平表达外，CD69在其它细胞静止状态下并不表达，而是在细胞激活后表达。早期的研究主要集中于它在 T细胞和 NK细胞中的表达［3，4］。静止的 T细胞或NK细胞一般不表达CD69，通过T细胞受体(T cell receptor，TCR)接受CD3/TCR复合物、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)、蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)激活物佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate，PMA)等刺激信号，1 h后细胞表面即有CD69的表达，此后CD69的表达迅速达到高峰，并可持续至72 h。但不同的刺激物诱导CD69表达的峰值时间有所不同。随后的研究发现，B细胞在PMA、抗IgM或金黄色葡萄球菌Cowan I(SAC)的刺激下也可表达CD69。中性粒细胞亦可在PAM刺激后表达CD69。对于CD69在嗜酸性粒细胞(eosinophils，Eos)表面的表达研究较少，直至1995年研究者利用国际第五工作室提供的473种人类白细胞抗体对人Eos表面抗原进行研究，发现静止的外周血Eos表面并不表达CD69，而体外粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte－macrophage colonystimulating factor，GM －CSF)、白细胞介素 －5(interleukin－5，IL－5)培养后的Eos及哮喘患者支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)中Eos均有CD69的表达［5］。其它实验显示体外细胞因子可诱导外周血 Eos表达 CD69，其中 IL－4、IL－13与肿瘤坏死因子－γ(tumor necrosis factor－γ，TNF－γ)有协同作用［6］。研究亦显示小鼠Eos佛波醇乙酯PMA等作用下1 h即有CD69的表达，在18 h 到高峰［7］。Yamamoto 等［8］进一步研究其表达机制，利用培养的单层人肺微血管内皮细胞，以IL－1β刺激其表达细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1)，哮喘患者外周血Eos通过该上皮层后有CD69、人白细胞DR抗原［human leukocyte antigen(locus)DR，HLA －DR］、ICAM －1表达显著增加及存活率显著增高。CD69的这种仅在不同细胞活化后表达的特性，使得它在许多研究中被作为细胞活化的标记分子。

CD69在以上这些细胞中的表达均为早期活化阶段。早期CD69的快速表达可能依赖于细胞内存储的CD69蛋白，而此后的持续表达则需要RNA的转录和蛋白质的合成。诱导CD69表达的机制主要是PKC的激活和细胞内Ca2+水平的持续增高［9］，阻断PKC通路可直接抑制CD69的表达［10］。后两者可作用于Ras蛋白，Ras蛋白与三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)连接，是一个重要的细胞内信号分子，而最近的研究显示Ras－GTP偶合蛋白不仅可促进活化信号Akt，MEK(丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶激酶，MAPK/ERK激酶)，细胞外信号调节激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)磷酸化，是CD69表达所必需的条件［11］。

CD69在活化细胞中的快速表达并不仅仅作为一个标记分子，事实上，它更重要的作用是作为细胞共刺激信号进一步增强细胞的活化或增殖分化。首先，CD69的表达可介导细胞激活后细胞因子的合成，如CD69+T细胞可有 IL－12β、IL－18α 和IL－16β mRNA水平增高，并在重组IL－12或IL－18的作用下有干扰素 － γ(interferon－ γ，IFN － γ)的产生［12］;由于缺乏明确的体内CD69配体，抗CD69mAb常用于分析CD69的作用。在刺激物如PMA的存在下，抗CD69 mAb可刺激T细胞分泌IL－2，进一步加快增殖，诱导单核细胞释放一氧化氮(nitric oxide，NO)，血小板细胞脱颗粒激活花生四烯酸代谢。抗CD69mAb可影响由IL－2激活的NK细胞对靶细胞的裂解作用。Eos表面CD69的表达与GM－CSF的自分泌密切相关。Dallaire等［13］亦发现Eos通过单层内皮细胞后即有CD69表达，并伴白三烯C4的释放增加。

CD69的这种细胞活化作用的机制并不明确。虽然CD69分子的胞内区非常短，且未有可识别的功能相关残基，尚未明确与其胞内分子相连的信号蛋白。但近来的研究显示CD69在NK细胞中可能激活Src通路中的Syk蛋白［14］。也有报道称CD69在细胞内信号转导通路中可通过偶合G蛋白来起作用。其确切机制这有待探讨。

3 CD69在细胞凋亡中的作用

虽然CD69在细胞活化中的有着重要作用，但近年来的研究显示，CD69的表达在体内与细胞的凋亡密切相关。在体内活化的具有CD69高表达的T细胞在体外易于快速自发凋亡［15］，CD69－/－小鼠腹腔和脾中淋巴细胞存活率增高，凋亡明显减少，脾淋巴细胞在激活后的凋亡明显低于野生型小鼠，并有凋亡信号caspase－3的活化减少［16］。研究发现PMA刺激后CD69高表达的Eos亦有凋亡的显著增加;国外有人在Eos体外培养时，加入antiCD69mAb可增加细胞凋亡，伴有抗凋亡信号B细胞淋巴瘤/白血病－2(B －cell leukemia－lymphoma，bcl－2)表达下降的报道［17］，且CD69与抗体的交联所诱导的Eos凋亡并不受周围环境中GM－CSF的影响［18］。

与死亡受体CD95相比，CD69介导的凋亡有其自己的特点［17］，CD95介导的凋亡几乎涉及所有细胞类型，而明确可由CD69介导的凋亡细胞主要为活化的嗜酸性粒细胞和单核细胞。另外，CD95在静止细胞及活化细胞上均可表达，因此CD95诱导的凋亡与细胞活化状态无关;而CD69在大多数静止、非活化的髓系细胞中无表达，仅在血小板和单核细胞中有结构性表达。CD69诱导的凋亡可选择性作用于被活化后的细胞，而对于非活化细胞则无此作用。以嗜酸性粒细胞为例，CD69在许多变态反应性疾病中，可作为嗜酸性粒细胞凋亡的一个理想死亡受体，它可诱导变态反应炎症部位聚集的活化嗜酸性细胞凋亡，从而改善局部炎症，但对于外周血中未活化的嗜酸性粒细胞则无此影响。因此，与CD95相比，以CD69作为诱导凋亡的靶目标副反应更小。另一方面，根据细胞种类的不同，CD69的作用具有多面性，如增加IgM抗体刺激后的B细胞增殖，增加单核细胞NO生成，活化单核细胞和NK细胞的细胞毒作用。目前尚未有抗CD69单抗对其它表达CD69的细胞(如T或B淋巴细胞)诱导凋亡的报道，但很可能是其诱导凋亡的路径尚未发现。

关于CD69介导细胞凋亡的分子机制仍不明确。研究显示CD69介导的单核细胞凋亡与3个不同的信号通路相关［19］:(1)依赖于NO;(2)与磷脂酶A2/磷脂氧化酶级联反应相关;(3)受百日咳毒素(PTX)敏感的G蛋白影响，且三者都是诱导单核吞噬细胞凋亡的必要不充分条件。此外，TGF－β可能在其中起一定的作用［16］。以胶原诱发的关节炎(collagen induced arthritis，CIA)为例［20］，CD69 缺陷鼠可因 T细胞和B细胞对胶原过度反应而导致CIA的急性发作，而此急性发作与炎症关节中TGF－β水平的降低相关。而抗TGF－β抗体在野生型小鼠中可加重CIA的严重程度，使得炎症细胞因子和炎症介质的分泌增加，但对CD69缺陷小鼠却无此作用。在NK细胞敏感的肿瘤模型中，CD69缺陷鼠中免疫细胞分泌TGF－β明显减少并导致淋巴细胞凋亡减少，从而增强了抗肿瘤的能力［21］。以上这些研究提示CD69可能通过介导TGF－β的合成来调节细胞的凋亡。

此外，CD69的分子结构、表达机制本身也存在其诱导凋亡作用的分子基础。CD69可与凋亡信号分子钙网织蛋白(calreticulin)的N末端相连接也提示CD69可能在细胞凋亡中起着重要的信号转导作用［2］;CD69的表达依赖PKC的激活和细胞内Ca2+水平的持续升高，而PKC激活、胞浆内Ca2+浓度升高都与细胞凋亡信号转导密切联系。此外，CD69高表达的T细胞可测到Fas的表达增加［22］，后者也是细胞凋亡的重要信号转导分子。另外，antiCD69mAb可下调抗凋亡基因bcl－2的表达，同样是促进细胞凋亡的一个重要机制。

综上所述，CD69不仅在细胞的活化中起着重要的促进作用，它与细胞活化后的凋亡也有着密切联系。

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