红车轴草醇提物的化学成分研究

张 念， 华茉莉， 姜仁吉， 孔德云

(上海医药工业研究院，上海200040)

红车轴草(Trifolium pratense L.)为豆科(Leguminosae)车轴草属多年生草本植物，又名红三叶草(Red Clover)、红花苜蓿和三叶草等，因植物中含有较为丰富的异黄酮，其提取物已被全球广泛应用于各种保健品或饮食增补剂中，用于预防乳腺癌、改善骨质疏松、妇女更年期综合症等［1-5］，许多国家因此将其纳入法定标准，美国药典-国家处方集的饮食增补剂分册(Botanical official monographs in USP30-NF25)就收载红车轴草植物、植物粉末、植物提取物、片剂的质量标准。在我国，红车轴草的植物资源十分丰富，南北各地均有野生分布和大面积栽培，每年对欧美市场出口大量的红车轴草提取物，其中多为醇提取物的初级加工品，同时我国外经贸部于2005年颁布实施的红车轴草提取物外贸行业标准与国际现行标准存在较大差异，因此对其开展系统的化学成分研究，不仅为其工艺改进、质量升级提供技术支撑，也为我国相关产品的国家标准制订提供研究依据。为此，作者对红车轴草乙醇提取物进行了化学成分的研究，从中分离并鉴定了13个单体化合物，分别为鹰嘴豆芽素A(Ⅰ)、芒柄花素(Ⅱ)、德鸢尾素 (Ⅲ)、红车轴草素(Ⅳ)、染料木素(Ⅴ)、大豆苷元 (Ⅵ)、槲皮素(Ⅶ)、山柰酚(Ⅷ)、芒柄花苷(Ⅸ)、德鸢尾苷(Ⅹ)、三十烷醇(Ⅺ)、熊果酸(Ⅻ)、β-谷甾醇(ⅩⅢ)。通过文献查阅，确定化合物Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ为首次从该植物中分离得到。

1 仪器与材料

RY-2型熔点测定仪，天津分析仪器厂;INOVA-400型核磁共振仪，Varian公司;MAT-212磁式质谱仪，Waters公司;Q-TOF质谱仪，Waters公司;半制备型液相色谱仪(Delta600 Pump，UV2487 Detector)，Waters公司。柱层析硅胶，100～200目，青岛海洋化工厂，批号080601;薄层层析硅胶H，青岛海洋化工公司，批号070910;薄层层析硅胶板，HSGF254，烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂，批号080915;葡聚糖凝胶，SephadexLH-20，Pharmacia公司，批号SH00001;色谱柱 CAPCELL PAK C18，20 mm I.D. ×250 mm，5 μm;所用化学试剂，均为分析纯，购自国药集团试剂有限公司及上海振兴化工一厂。

药材于2007年10购自江西，经上海医药工业研究院中药研究室吴彤副研究员鉴定为豆科植物红车轴草(Trifolium pratense L.)，药材样品保存于中药研究室备查。

2 提取与分离

红车轴草干燥药材3 kg，切段，以20倍量80%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩得稠浸膏约400 g，所得浸膏以甲醇溶解，滤液加适量硅胶拌样，进行硅胶(100～200目)柱层析，以石油醚、石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识跟踪合并相同或相似洗脱流份，所得各洗脱部位再经薄层层析硅胶柱层析，并结合SephadexLH-20凝胶柱层析、薄层制备、反相液相制备色谱等方法，分离得到13个单体化合物，其中包括8个异黄酮成分和2个黄酮成分。

3 结构鉴定

化合物Ⅰ:黄色针状结晶(CH3OH)，mp 212～214 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.36(1H，s，H-2)，12.91(1H，s，OH-5)，10.90(1H，s，OH-7)，7.47(2H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′)，6.98(2H，d，J=8.0 Hz，H-3′，5′)，6.37(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，3.77(3H，s，OCH3)。13CNMR(DMSO-d6)δ:154.3(C-2)，122.9(C-3)，180.1(C-4)，161.9(C-5)，99.0(C-6)，164.3(C-7)，93.7(C-8)，157.5(C-9)，104.4(C-10)，122.9(C-1′)，130.1(C-2′)，113.7(C-3′)，159.2(C-4′)，113.7(C-5′)，130.2(C-6′)，55.2(OCH3)。依据其理化性质及其波谱数据与文献报道鹰嘴豆芽素A基本一致［6］，鉴定该化合物为鹰嘴豆芽素 A(Biochnain A)。

化合物Ⅱ:无色针状结晶(CH3OH)，mp 250～252 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:10.79(1H，s，H-7)，8.32(1H，s，H-2)，7.96(1H，d，J=8.7 Hz，H-5)，6.93(1H，dd，J=8.7，2.4 Hz，H-6)，6.85(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，7.50(2H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′)，6.98(2H，d，J=8.0 Hz，H-3′，5′)，3.77(3H，s，OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:153.2(C-2)，124.2(C-3)，174.6(C-4)，127.3(C-5)，115.2(C-6)，162.6(C-7)，102.1(C-8)，157.5(C-9)，116.6(C-10)，123.2(C-1′)，130.1(C-2′)，113.6(C-3′)，158.9(C-4′)，113.6(C-5′)，130.1(C-6′)，55.1(OCH3)。依据其理化性质及其波谱数据与文献报道芒柄花素基本一致［7-10］，鉴定该化合物为芒柄花素(Formononetin)。

化合物Ⅲ:淡黄色针状晶(CH3OH)，mp 236～237 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.42(1H，s，H-2)，12.92(1H，s，OH-5)，9.61(1H，s，OH-4′)，7.38(2H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′)，6.82(2H，d，J=8.0 Hz，H-3′，5′)，6.87(1H，s，H-8)，6.17(2H，s，OCH2O)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:154.5(C-2)，122.1(C-3)，180.9(C-4)，141.4(C-5)，129.6(C-6)，154.5(C-7)，89.5(C-8)，153.0(C-9)，107.4(C-10)，120.9(C-1′)，130.2(C-2′)，115.1(C-3′)，157.5(C-4′)，115.1(C-5′)，130.0(C-6′)，102.9(-OCH2O-)。依据其理化性质及其波谱数据与文献报道德鸢尾素基本一致［6，11，13］，鉴定该化合物为德鸢尾素(Irilone)。

化合物Ⅳ:无色针状结晶(CH3OH)，mp 272～273 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:5.33(1H，s，H-2)，12.95(1H，s，OH-5)，10.88(1H，s，OH-7)，9.05(1H，s，OH-3′)，7.02(1H，brs，H-6′)，6.95(2H，m，H-2′，5′)，6.36(1H，d，J=1.5 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=1.5 Hz，H-6)，3.80(3H，s，OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:55.7(OCH3)，154.3(C-2)，122.2(C-3)，180.2(C-4)，162.0(C-5)，99.0(C-6)，164.3(C-7)，93.9(C-8)，157.6(C-9)，104.5(C-10)，123.3(C-1′)，116.4(C-2′)，146.1(C-3′)，147.7(C-4′)，112.0(C-5′)，119.8(C-6′)。依据其理化性质及其波谱数据与文献对照［13］，鉴定该化合物为 5，7，3′-三羟基-4′-甲氧基异黄酮，即红车轴草素(Prat-ensein)。

化合物Ⅴ:无色针状结晶(CH3OH)，mp 293～295 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.30(1H，s，H-2)，12.94(1H，s，OH-5)，10.86(1H，s，H-7)，9.58(1H，s，H-4′)，7.36(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)、6.80(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.37(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)、6.21(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:153.9(C-2)，121.2(C-3)，180.2(C-4)，162.0(C-5)，99.0(C-6)，164.3(C-7)，93.7(C-8)，157.4(C-9)，104.5(C-10)，122.3(C-l′)，130.2(C-2′)，115.1(C-3′)，157.6(C-4′)，115.1(C-5′)，130.2(C-6′)。依据其理化性质及其波谱数据与文献报道染料木素基本一致［10，12，14，15］，鉴定该化合物为染料木素(Genistein)。

化合物Ⅵ:无色针状结晶(CH3OH)，mp 311～312 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:10.76(1H，s，H-7)，9.51(1H，s，H-4′)，8.27(1H，s，H-2)，7.95(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，6.93(1H，dd，J=8.5，2.0 Hz，H-6)，6.86(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，7.36(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.79(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:152.8(C-2)，122.5(C-3)，174.7(C-4)，127.3(C-5)，115.1(C-6)，162.5(C-7)，102.1(C-8)，157.4(C-9)，116.6(C-10)，123.5(C-l′)，130.1(C-2′)，114.9(C-3′)，157.1(C-4′)，114.9(C-5′)，130.0(C-6′)。依据其理化性质及其波谱数据与文献报道大豆苷元基本一致［14-16］，鉴定该化合物为大豆苷元(Daidzein)。

化合物Ⅶ:黄色粉末(CH3OH)，mp 306～308℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.48(1H，s，OH-5)，10.79(1H，brs，OH-7)，9.59(1H，brs，OH-3)，9.30(2H，brs，H-3′，4′)，6.39(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，7.66(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，7.53(1H，dd，J=8.5，2.0 Hz，H-6′)，6.87(1H，J=8.5 Hz，H-5′)。依据其理化性质及其1H-NMR数据与文献报道槲皮素基本一致［15］，且该化合物与槲皮素对照品在多种溶剂系统展开的薄层色谱，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，故鉴定该化合物为槲皮素(Quercetin)。

化合物Ⅷ:黄色针状结晶(CH3OH)，mp 276～278 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.46(1H，s，OH-5)，10.78(1H，brs，OH-7)、10.10(1H，brs，OH-3)，9.39(1H，brs，OH-4′)，8.02(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.92(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.17(1H，d，J=1.5 Hz，H-6)，6.42(1H，d，J=1.5 Hz，H-8)。13CNMR(DMSO-d6)δ:175.9(C-4)，163.9(C-7)，160.7(C-9)，159.2(C-4′)，156.2(C-5)，146.8(C-2)，135.8(C-3)，129.5(C-2′，6′)，121.7(C-1′)，115.6(C-3′，5′)，103.0(C-10)，98.2(C-6)，93.5(C-8)。依据其理化性质及其波谱数据与文献报道山柰酚基本一致［17］，因而鉴定该化合物为山柰酚(Kaemferol)。

化合物Ⅸ:白色针状结晶(CH3OH)，mp 213～216 ℃。ESI-MS(m/z):453［M+Na］+，267［M-Glucose］－。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.44(1H，s，H-2)，8.06(1H，d，J=9 Hz，H-5)，7.25(1H，d，J=2 Hz，H-8)，7.15(1H，dd，J=9.2 Hz，H-6)，7.53(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，7.00(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，5.12(1H，d，J=7.0 Hz，anomeric H)，3.79(3H，s，OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:174.7(C-4)，161.5(C-7)，159.0(C-4′)，157.1(C-8a)，153.7(C-2)，130.1(C-2′，6′)，126.9(C-5)，124.0(C-1′)，123.4(C-3)，118.5(C-4a)，115.6(C-6)，113.6(C-3′，5′)，103.4(C-8)，99.9(C-1″)，77.2(C-3″)，76.5(C-5″)，73.1(C-2″)，69.6(C-4″)，60.6(C-6″)，55.2(OCH3)。依据其理化性质及其波谱数据与文献数值对照［8］，鉴定该化合物为芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖 苷 (7-O-β-D-glucosyl-7-hydroxy-4′-methoxyisflavone)，即芒柄花苷(ononin)。

化合物Ⅹ:白色晶体(CH3OH)，mp 188～189℃。ESI-MS(m/z):483［M+Na］+，459［MH］－。1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.86(1H，s，OH-5)，8.30(1H，s，H-2)，7.45(2H，d，J=7.2 Hz，H-2′，6′)，7.08(1H，d，J=7.2 Hz，H-3′，5′)，6.72(1H，s，H-8)，6.092(2H，s，OCH2O)，4.88(1H，d，J=7.2 Hz，anomeric H)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:180.7(C-4)，157.3(C-4′)，154.8(C-5)，153.9(C-9)，153.1(C-2)，141.5(C-7)，130.1(C-2′，6′)，129.7(C-6)，124.0(C-1′)，121.8(C-3)，116.0(C-3′，5′)，107.6(C-10)，102.8(OCH2O)，100.3(C-1″)，89.4(C-8)，77.1(C-3″)，76.6(C-5″)，73.2(C-2″)，69.7(C-4″)，60.7(C-6″)。依据其理化性质及其波谱数据与文献数值对照［18］，鉴定该化合物为 5-羟基-6，7-亚甲二氧基异黄酮-4′-O-葡萄糖苷(5-hydroxy-6，7-methylenedioxyisoflavone-4′-glucoside)，即德鸢尾苷(Irilone-4′-glucoside)，为首次从该植物中分离得到。

化合物Ⅺ:白色片状结晶(CHCl3)，mp 86.5～87.5 ℃。EI-MS(m/z):420［M+H2O］－，392，363，181，153，139，125，111，83，97，69，57(100)，43。其质谱信息经数据库检索，并结合其裂解规律及相关文献［19］，确定该化合物为三十烷醇(Triacontanol)，为首次从该植物中分离得到。

化合物Ⅻ:白色粉末(CH3OH)，mp 277～278℃。ESI-MS(m/z):479［M+Na］+，455［MH］－。1H-NMR(DMSO-d6)δ:11.954(1H，s，-COOH)，5.12(1H，d，J=10 Hz，H-12)，4.29(1H，d，J=4.5 Hz，H-3)，0.66，0.83，0.85，0.86，1.02 提示有5 个季碳甲基(3H，s)，δ0.79(3H，d，J=6 Hz)，δ0.90(3H，d，J=6 Hz)为叔碳甲基。13C-NMR(DMSO-d6)δ:178.3(COOH)，138.2(C-13)，124.6(C-12)。依据其理化性质及其波谱数据与文献报道熊果酸基本一致［20］，且该化合物与熊果酸对照品在多种溶剂系统展开的薄层色谱，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，鉴定该化合物为熊果酸(Ursolic acid)，为首次从该植物中分离得到。

化合物す:白色针晶(CHCl3-CH3OH)，mp 136～138 ℃。EI-MS(m/z):414［M］+，396，381，329，303，273，255，231，213，199，145，95，69，55，43。其质谱信息经质谱数据库检索与β-谷甾醇吻合，且该化合物与β-谷甾醇对照品在多种溶剂系统展开的薄层色谱，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，因而鉴定该化合物为β-谷甾醇(β-sitosterol)。

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