革兰阳性菌青霉素结合蛋白研究进展*

朱竟赫,郭文洁,刘耀川,赵敬翠,庞 杰,刘明春

(沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳 110161)

青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs)是细菌胞浆膜上的一种微小蛋白质,分子质量在30 ku～150 ku之间。PBPs由Suginaka等于1972年第一次报道,当时发现它能和青霉素共价结合而得名。后来研究发现PBPs也能与非β-内酰胺类抗生素结合[1]。本文综述了革兰阳性菌PBPs研究进展。

1 概述

多数细菌都有细胞壁,用以维持细胞形态以及抵抗内部膨胀压力。革兰阳性菌细胞壁的主要成分是肽聚糖,它是聚糖丝由肽类交联而成的网状高分子物质。聚合过程中存在3种关键的酶类,即糖基转移酶、肽基转移酶和D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶(D,D-羧肽酶)。糖基转移酶可延长双糖肽的多糖链;肽基转移酶的可是使双糖肽相互交联聚合成网状的肽聚糖;D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的可在转肽作用过程中由羧肽酶催化将D-丙氨酰-D-丙氨酸间的肽链断裂,释放出一个D-丙氨酰残基。肽聚糖合成过程中的某些反应就是由PBPs家族的某些成员催化完成的[2]。

β-内酰胺类抗生素能专一性地与细菌细胞内膜上的PBPs结合,干扰PBPs的正常酶功能(如干扰细胞壁肽聚糖合成),使细胞壁合成阻断。不同的β-内酰胺类抗生素与不同的PBPs结合,可引起细菌自溶、形成球形体或形成丝状细胞,最终细菌停止分裂而死亡。PBPs是参与细菌细胞壁的合成、形态维持和糖肽结构调整等作用的一组酶。PBPs介导的细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性可能与PBPs的改变有关:①PBPs含量必需发生变化或缺失;②与抗生素的亲和力降低;③细菌产生缓慢结合的PBPs;④诱导性 PBPs的出现,即不依赖β-内酰胺酶的存在而对β-内酰胺类抗生素耐药。这种由PBPs介导的耐药性在革兰阳性菌比革兰阴性菌中更常见,如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphy lococcus aureus,MRSA)、耐青霉素肺炎球菌(penicillin resistant strep tococcus pneumoniae,PRSP)等[3]。

另外,在革兰阴性菌中有外膜存在,且具有非常有效的通透屏障作用,能阻碍抗生素进入细胞内膜靶位,减少抗生素的吸收;而大多数革兰阳性菌具有一层很厚的肽聚糖细胞壁,无细胞外膜,机械性强,但因其筛子结构粗糙,很难阻止小分子物质,如抗生素的扩散。所以多数革兰阳性菌不存在膜通透性下降的耐药机制[4]。

2 PBPs分类

2.1 按氨基酸序列的相似程度分类

按氨基酸序列的相似程度可将PBPs分为A型高分子质量PBPs、B型高分子质量PBPs和低分子质量PBPs三类。A型高分子质量PBPs是一类双重功能的PBPs,它的N末端具有糖基转移酶的作用,C末端具有肽基转移酶的作用。B型高分子质量PBPs只有肽基转移酶的活性,在某些情况下,具有维护细胞形态的作用。低分子质量PBPs普遍具有D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶(D,D-羧肽酶)的活性,可催化D-丙氨酰-D-丙氨酸间的肽链断裂,释放出一个D-丙氨酰残基,在肽聚糖交联过程中起重要作用[5]。

2.2 根据细菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性分类

根据细菌对各种β-内酰胺类抗生素的敏感性不同,可将PBPs大致分为两类:①对青霉素的敏感性稍差,但对大多数头孢菌素敏感的PBPs。其分子质量较低(24.8 ku～34.7 ku),一般为D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶,如金黄色葡萄球菌的PBP4。②对青霉素和头孢菌素均敏感的 PBPs。其分子质量较高(59.5 ku～89.3 ku),羧基末端是青霉素结合域,催化青霉素敏感的肽聚糖转肽酶反应,氨基末端催化青霉素不敏感的肽聚糖转糖基酶反应。

已知不同的抗生素作用于不同的PBPs上,即使是同一抗生素对于不同细菌也是作用于不同的PBPs上。如头孢噻肟作用于链球菌的靶位是PBP2x,而作用于金黄色葡萄球菌的靶位是PBP2;苯唑西林也主要作用于金黄色葡萄球菌的PBP2,而金黄色葡萄球菌的PBP3却是头孢拉定的主要作用点。作用于同一PBPs靶位的抗生素合用会产生相互拮抗作用,作用于不同PBPs的β-内酰胺类抗生素在联用时可产生协同作用[6]。

2.3 根据与细菌生理功能的关系分类

根据与细菌生理功能的关系大致可以将PBPs分为细菌生长必需蛋白和非必需蛋白。仍以耐药金黄色葡萄球菌为例,PBP1、PBP2、PBP3、PBP4为其固有的蛋白质,而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M RSA)中的PBP2a为耐药菌所特有的,不是菌体必须的蛋白质,但有了它细菌可对青霉素产生耐药性。

3 革兰阳性菌的PBPs及相关机制

不同细菌的PBPs组成不同,其功能和耐药机制也有一定的差别。研究表明,并非所有的PBPs都是抗生素的作用靶位。现在研究得比较多的是肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌等。

3.1 肺炎链球菌

有研究发现肺炎链球菌共有6种PBPs,它们分别是 PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2x、PBP2b 和 PBP3。其分子质量分别为 100、100、89.4、82、78 和43 ku 。敏感肺炎链球菌的PBP-1a/1b、PBP-2a/2x/2b都很容易被β-内酰胺类抗生素结合而达到杀菌目的[7]。肺炎链球菌耐药株4个分子质量较大的PBP1a、PBP2x、PBP2a和PBP2b与青霉素的亲和力明显降低。这4个PBPs是β-内酰胺类抗生素作用的致命靶点[8]。肺炎链球菌对青霉素耐药是多基因逐步变异累加的结果,其中 PBP1a、PBP2x和 PBP2b起主要作用,PBP2x和PBP2b为原耐药抗性决定簇,它们的变异可导致低水平耐药。当PBP1a发生变异时通常导致高水平耐药,但与此同时 PBP2x和PBP2b中至少应该有一种发生变异[9]。最近研究显示由镶嵌基因导致的低亲和力PBP2x和PBP1a是产生高水平头孢噻肟耐药的主要原因[10]。

3.2 格登链球菌

格登链球菌具有3种A型高分子质量青霉素结合蛋白,分别是 PBP1a、PBP1b、PBP2a和 2种 B型青霉素结合蛋白,分别是PBP2b和PBP2x。它们对于青霉素耐药是很重要的。在格氏链球菌高耐药菌株中,发生变异的基因是pbp2b和pbp2x。尽管耐药株中 pbp1a、pbp1b、pbp2a不发生变异,但它们在耐药过程中仍然起着重要的作用。灭活PBP1a和PBP2a中的任何一个,该菌株都不能产生耐药性,且 pbp2b和pbp2x也不能发生变异[11]。

3.3 金黄色葡萄球菌

PBP2a是金黄色葡萄球菌产生耐药性的主要青霉素结合蛋白。据目前研究,甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌存在 5种PBPs,即PBP1(84.3 ku)、PBP2(80.4 ku)、PBP3(74.4 ku)、PBP4(44.6 ku)以及PBP2b。PBP2b是由pbpF基因编码的,含有691个氨基酸,分子质量为 77.4 ku。近年研究表明PBP1在肽聚糖交联过程中不起主要作用,它的功能必须整合到细胞分裂机制过程中才能发挥作用[12]。另外,在甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌中还有PBP2a,此蛋白由macA基因编码。m acA是MRSA的主要耐药基因。m ecA仅存在于MRSA和极少数耐甲氧西林的表皮葡萄球菌中,其编码产物PBP2a可替代菌体原有的由pbp2基因编码的PBP2蛋白。PBP2a与青霉素的结合能力较差,可维持菌体肽聚糖的稳定,从而使细菌产生耐药性[13]。此外,金黄色葡萄球菌中的PBP1是一种肽酰转移酶,在金葡菌细胞周期中PBP1起双重作用,它既是细胞分隔中的必需蛋白又是一种在细胞分裂末期产生关键信号的肽酰转移酶[14]。

3.4 肠球菌

肠球菌对青霉素的耐药机制主要有3种:①β-内酰胺酶机制。②产生过剩的PBP4或PBP5机制;③PBP4或PBP5青霉素结构域变异导致的青霉素亲和力降低机制[15]。在肠球菌属中,PBPs的C端是β-内酰胺类抗生素的结合靶位,由3个氨基酸保守盒STFK、K TG和SDN构成,基因突变均发生在其邻近区域,使肠球菌对β-内酰胺类抗生素的亲和力降低[16]。其中,引起粪肠球菌耐药的低亲和力PBPs为PBP4[15],屎肠球菌为PBP5[16]。最近研究发现粪肠球菌对非典型粪肠球菌药法罗培南的耐药机制主要是产生低亲和力PBP4[15]。PBP5为B类PBPs,经鉴定屎肠球菌中存在两种A类 PBPs即PbpF和PonA与PBP5相配合,肽聚糖丝可由A类PBPs独立合成,当PbpF和PonA缺失是可导致肽聚糖交联减少[17]。

3.5 枯草芽孢杆菌

在枯草芽孢杆菌中主要有16个PBPs,按序列相似性划分它们包括4个A型高分子质量PBPs,6个B型高分子质量PBPs和6个低分子质量PBPs。它们在肽聚糖合成、细胞形态、芽孢形成和芽孢萌发方面有着各种作用。4种A型PBPs分别是PBP1、PBP2c、PBP4 和 PBP2d。其中 PBP1、PBP2c和PBP4缺失,尤其是PBP1的缺失,将引起繁殖体生长率下降和芽孢生长量减少[18]。有研究表明Ywhe(第4号A型PBPs编码基因)在繁殖体的肽聚糖合成中无作用,并且其编码的蛋白Ywhe只在前芽孢中存在。PBP2c在繁殖体和芽孢中均有发现。PBP2c可能和Ywhe一起与芽孢肽聚糖合成及芽孢萌发有关[19]。B型PBPs在维持细胞形态方面有特殊的作用,它的序列使它具有与大肠埃希菌PBP3(由ftsI编码)相似的功能。枯草芽孢杆菌的PBP2a(由pbpA编码)在芽孢生长时从椭圆形孢子形成杆状细胞的过程中起重要作用。它与大肠埃希菌的PBP2类似,也是维持细菌杆状形态的。枯草芽孢杆菌PBP3,由 pbpC编码,从细菌生长、芽孢形成、芽孢萌发几个方面来看并不是十分重要。spoVD的产物是B型PBP,在芽孢肽聚糖合成方面有重要作用。另外两个B型PBP ykuA和yrrR的作用尚未确定。低分子质量PBPs为D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶,转肽时有催化D-丙氨酰-D-丙氨酸间的肽链断裂的作用[20]。

细胞分裂蛋白 EzrA和一个新发现的蛋白GpsB在枯草芽孢杆菌延伸-分配循环中起关键作用。这些基因的突变导致细菌在细胞分裂和细胞延长中的综合表型缺陷。它们还导致细胞极点成熟作用失败。EzrA主要促进PBP1向特定部位聚集,而GpsB则主要促进PBP1在完成极点成熟作用后与细胞极点分离[21]。

3.6 棒状杆菌

在棒状杆菌中通常有8个高度保守的PBPs,以谷氨酸棒状杆菌为例,其中有4种高分子质量PBPs(HMW-PBPS),分别为 PBP1a、PBP1b、PBP2a 和PBP2b;两种低分子质量青霉素结合蛋白(LMWPBPS),分别为PBP4和PBP4b;还有两种可能存在的结合性β-内酰胺酶,它们也具有结合β-内酰胺类抗生素的能力,分别称为PBP5和PBP6。Valbuena N等[22]用基因敲除的方法研究得出,在4种HMWPBPS中PBP1b和PBP2b最为重要,只有当PBP1b和PBP2b同时缺失时对于细菌才是致命的,细菌无法生长。

3.7 分支杆菌

分支杆菌中主要存在4种PBPs,按分子质量大小排列分别为 PBP1、PBP2a、PBP2b和 PBP3,它们的表观分子质量分别为 102、90、87、50 ku。在多数情况下分支杆菌对β-内酰胺类抗生素有固有的耐药性。其原因有PBPs对β-内酰胺类抗生素的亲和力降低、产生β-内酰胺酶、细菌对β-内酰胺类抗生素的通透性降低。分支杆菌的耐药性为这3种机制的综合表现[23]。研究显示,结核分支杆菌中存在一种PBPA,它使B型高分子质量PBPs,可以结合氨苄青霉素,在细胞分裂和维持细胞形态方面有重要作用,在丝氨酸-苏氨酸激酶PknA和PknB调节下参与细胞中隔的肽聚糖合成[24]。

总之,青霉素结合蛋白在革兰阳性菌细胞壁合成过程中起着至关重要的作用,其种类很多,编码基因不同,分子质量大小也有不小的差异,但其作为肽聚糖合成中的关键酶类的功能相近。在发生β-内酰胺类抗生素耐药时,PBPs相应的基因发生变异,构成了细菌耐药机制中的重要部分。因此进一步深入研究革兰阳性菌的PBPs及其相关耐药机制,将对临床用药及新药开发提供重要参考。

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