毛细管电泳芯片的临床应用现状

李婧

毛细管电泳芯片的临床应用现状

李婧

毛细管电泳；芯片；临床应用

毛细管电泳芯片（microchip capillary electrophoresis）是在常规毛细管电泳（capillary electrophoresis,CE）的原理和技术基础上，利用微加工技术在平方厘米级大小的芯片上加工出各种微细结构，如通道和其它功能单元，通过不同的通道、反应器、检测单元等的设计和布局，实现样品的进样、反应、分离和检测，是一种多功能化的快速、高效和低耗的微型实验装置。该项技术可望发展成微全分析系统和芯片实验室的主流技术。它的研究和广泛应用，将使疾病诊断和治疗、环境监测、新药研究开发、食品安全检测等许多领域产生革命性变化，已成为当今化学、生命科学、微机械、物理、计算机、微电子技术等领域的重要研究课题之一。到目前为止，毛细管电泳芯片已用于糖类化合物的分离检测、氨基酸对应体的拆分、蛋白质和多肽分析、神经递质类物质的分离检测、寡核苷酸的分离、DNA测序和DNA限制性片段分离等分离分析研究。随着应用实践的增加，该项技术将成为临床实验室的有效分析工具。

1 肿瘤

已有利用毛细管电泳芯片方法分析肿瘤敏感性基因的报道，包括单链构象多态性分析和等位基因特异性DNA扩增结合杂交双链分析。BRCA1和BRCA2基因中常见突变与乳腺癌呈强相关性，尤其是在北欧犹太教人群中。利用毛细管电泳芯片，Tian等[1,2]将单链构象多态性分析时间降低到约130 s，比传统方法至少提高了100倍。他们又将等位基因特异性DNA扩增与杂交双链分析联合，检测BRCA1和BRCA2基因中每个突变。该系统也被用于分析T和B淋巴细胞增殖失调，结果表明毛细管电泳芯片提供与平板凝胶电泳和传统毛细管电泳相同的信息，但是分析时间更短（毛细管电泳芯片为160 s，平板凝胶电泳为2.5 h，毛细管电泳为15 min）。Thomas等[3]在充满各种分离基质的微通道中进行毛细管电泳来快速分析基因组DNA中低丰度点突变的连接酶检测产物。在来自结直肠肿瘤的DNA中检测人k-ras癌基因中点突变，在不到120 s内将连接酶检测反应产物与未连接引物区分，比毛细管凝胶电泳快17倍，只是分辨率轻度降低。Cantafora等[4]用结合竞争和毛细管电泳芯片的逆转录PCR评价了参与人类肠道细胞脂类运输的信使RNA，结果显示分析特定信使RNA能够可靠评价CaCo-2细胞中相应基因的表达，并证明胆固醇作为特定因子如LXR-α和FXR正向诱导剂的作用。还可以在芯片上进行酶学分析来测定蛋白激酶。分析试剂通过电渗流被混合在雕刻的通道内，用荧光素标记的七肽作为底物进行酶反应。底物和反应产物被电泳分离，结果证明毛细管电泳芯片对于无法获得荧光底物而需要进行酶学分析十分有用[5]。

2 心血管相关疾病

现已证明毛细管电泳芯片可以作为分析LDL和同型半胱氨酸来评价动脉粥样硬化的一种诊断工具[6,7]。而且，还可以通过分析细胞中DNA片段来评价个体心肌细胞的凋亡，从而诊断阿霉素诱导的心肌病，后者化疗患者的一种危及生命的状态。基于毛细管电泳芯片的电化学检测已被用于分析总同型半胱氨酸和结合蛋白的同型半胱氨酸，该技术可以用于有心血管病风险患者的常规检测。Kleparnik等[8]在芯片中用CD样微液体设备进行细胞裂解、电泳和激光诱导荧光测定阿霉素诱导的个体心肌细胞凋亡。通过分析阿霉素处理不同时间的细胞中DNA片段检测凋亡。结果显示心肌细胞暴露阿霉素的时间延长与细胞坏死相关。

3 肾脏标志物

分析生物体液中的肌酐、肌酸、尿酸、尿素和对氨基马尿酸能够评价肾脏和肌肉功能。现人们已经将芯片分析肾脏标志物与电化学检测联合应用。一种方法是将使用肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶的酶学生物分析和电泳分离与电流计测定相偶联。金覆盖的厚膜电极用于电流计检测，检测限为2×10-5～4×10-5mol/L（信噪比为3）[9]。另一种方法是通过脉冲电流测定含氮化合物和更易氧化的尿酸来直接测定肾脏标志物。四种肾脏标志物在5 min内轻松测定。在不到2 min内即可测定肌酐/肌酸比值，而传统肌酐分析方法需要约20 min[10]。可见毛细管电泳芯片能够快速、简便、经济的测定肾功能，对于零散的临床检测和床边检测具有潜在的优点。

4 神经系统疾病

毛细管电泳芯片已经被用于分析脑脊液（CSF）标本测定炎性细胞因子和神经功能酶的抑制剂。Lapos等[11]利用毛细管电泳芯片设备结合双激光诱导荧光（LIF）和电化学检测装置分析多发性硬化患者脑脊液标本。基于芯片的免疫吸附分离还可以与毛细管电泳结合用于快速分析脑脊液中炎性细胞因子。一组6个固定抗体被粘附在芯片的注射孔中来分离创伤性脑损伤患者脑脊液中反应性细胞因子[12]。

5 甲状腺功能

Schmalzing等[13]描述了一种竞争性免疫分析方法测定血清甲状腺素，原理是在融合的硅芯片中进行电泳分离和LIF检测。分析速度比传统的免疫分析和毛细管电泳显著加快，在约15 min内分离血清中未标记的甲状腺素。另外，一种使用二茂络铁氧化还原标记的基于芯片的电流计竞争性免疫分析已被用于测定三碘甲腺原氨酸。该分析由芯片、标记抗原和靶抗原与抗体的柱前反应、游离和结合的标记抗原的电泳分离和电流计检测氧化还原标签组成。最小检测浓度是1000 μg/L，分析时间130 s[14]。虽然上述方法是用于测定甲状腺功能，但是将免疫反应、电泳分离和灵敏的检测系统整合在芯片平台上能快速进行更多分析物的免疫分析。

6 感染性疾病/病原体

由于某些感染性疾病的急性本质以及日益增加的恐怖威胁，高速高效的毛细管电泳芯片可能成为测定病原体和诊断感染性疾病的有力工具。现可以用毛细管电泳芯片检测样本中病毒和细菌的存在。目前多数研究集中于分析提取的和PCR扩增的核酸片段而非完整的病毒或细菌颗粒。

6.1 病毒感染Zhou等[15]开发了一种微液体系统测定严重急性呼吸综合征冠状病毒。与传统逆转录PCR相比，该系统对于临床诊断严重急性呼吸综合征患者的咽拭子具有更高阳性率（17/18对12/18，阳性鉴定），且更快速。Chen等[16]定性和定量分析了丙型肝炎病毒。对于定性分析，他们用塑料芯片分析了利用2对扩增5’非编码区的引物产生的2步PCR产物。毛细管电泳芯片装置能在不到1.5 min内分辨丙型肝炎病毒的145 bp扩增子。定量分析运用了逆转录竞争性PCR。从血清中提取的野生型RNA与已知量的具有相同引物结合区域（删除了靶RNA特定中心位点的25 bp片段）的重组内标准RNA共同逆转录和共同扩增。该结果与商品化杂交分析结果相当，但降低了工作强度。通过分析CSF中提取DNA的PCR产物能进行单纯疱疹病毒诊断。Hofgartner等[17]用毛细管电泳芯片分析33个CSF样本中的已知DNA进行单纯疱疹病毒PCR检测。与已经建立的方法相比，毛细管电泳芯片达到100%灵敏度和特异性的分析时间更短。因为省略了杂交步骤，实时定量荧光PCR也具有快速分析的优点，但是需要昂贵的设备。相反，毛细管电泳芯片技术则具有多方面优点，它能检测各种荧光标记的临床标志物，而且除分离和检测步骤以外还加入了其他实验功能。Vegvari等[18]发展了一种杂交微设备，用聚氯乙烯载板和融合成U型沟的硅芯片来分析各种标本，包括肽、蛋白、DNA、病毒和细菌。因为融合硅毛细管具有高透光性，适用于紫外线检测，所以人们期待该设备能得到广泛应用。

6.2 细菌感染将PCR和CE整合的芯片设备已经被用于分析细菌，如大肠杆菌、葡萄球菌、沙门菌和链球菌。Lagally等[19]研发了一种集成化便携式基因分析系统检测病原体。该系统可以同时检测被检细胞群的血清型和病原状态以及抗生素抗性。也出现了其它集成细胞裂解、多重PCR扩增和带有标志物的PCR产物的电泳分离的芯片设备。例如，整合了PCR、微液体泵和电泳的塑料微液体设备可以进行细菌检测和鉴定，可以成功分析该设备PCR反应产生的大肠杆菌和沙门菌基因组DNA的扩增子[20]。

7 免疫失调

IgG与慢性感染（多克隆增加）或癌症（单克隆增加）相关，现已出现了几种毛细管电泳芯片方法检测IgG浓度增加。Linder等[21]发展了一种非均质竞争性免疫分析测定人IgG，用Cy5-人IgG作为示踪物，Cy3-鼠IgG作为内标准。定量血清中人IgG十分困难，因为IgG浓度低时SD相对高，浓度高时浓度依赖性又差。但是，区分IgG增加的患者血清标本（慢性感染患者中的35.5 g/L和骨髓瘤患者中的64.7 g/L）和那些IgG浓度在参考范围内的标本还是较容易的。带有短毛细管的传统CE和玻璃微芯片CE设备被用于分析异硫氰酸荧光素标记的抗人IgG。微芯片设备有几个优点，包括高效、快速、样本和试剂用量少。Wang等[22]描述了一种在芯片平台上进行的电化学酶免疫分析。碱性磷酸酶标记的抗体与抗原进行柱前反应，电泳分离游离抗体和抗体-抗原复合物，酶示踪物和4-氨基苯磷酸底物的柱后反应，电流计检测被释放的4-苯酚等操作均在同一设备上进行。

8 糖尿病

胰岛素和葡萄糖测定对于诊断糖尿病、胰岛细胞失能、低血糖和胰岛素瘤十分重要。几项研究尝试用毛细管电泳芯片测定胰岛素和葡萄糖。Wang等[23]利用双免疫和酶芯片分析同时测定胰岛素和葡萄糖。胰岛素免疫检测使用碱性磷酸酶标记的抗体和柱后加入对硝基苯酚磷酸盐底物，葡萄糖分析用葡萄糖脱氢酶和NAD+进行。现已研制出基于连续电泳的免疫分析用于监测活细胞激素分泌的微液体芯片。可以用CE竞争性免疫分析检测胰岛分泌的胰岛素。可以得到胰岛素分泌谱，观察到胰岛素分泌的一期和二期特点。毛细管电泳芯片系统非常适合以高时间分辨率监测活细胞的化学环境，该装置可以用于常规临床实验室。

9 遗传病

毛细管电泳芯片还可以分析遗传病如进行性假肥大性肌营养不良（DMD）和血色素沉着病，以及分析基因组DNA。DMD是由X染色体上的营养障碍基因的突变导致的。通过检测该病携带者基因中重复或删除的外显子可以鉴定疾病。与DMD相关的删除/重复倾向于定位在基因的某个区域，因此直接分析一定数目PCR扩增DNA片段即可进行诊断DMD。红外线介导的PCR扩增与毛细管电泳芯片的DNA分离相偶合的集成微装置就是为此目的而发展的。其原理是，红外线辐射直接加热PCR混合物但不加热芯片，加快了温度循环并缩短分析时间。但PCR循环期间芯片筛分基质缓冲液影响了分离效率。因此在成功应用之前必须解决加热与PCR整合在一起的问题。尽管如此，与传统方法比较（如Southern blot），PCR-CE极大节省了时间、人力和材料，解决了加热问题可能会使基于毛细管电泳芯片的诊断装置用于遗传病的诊断[24]。Ertl等[25]开发了一种鞘液流动支持的电化学检测系统，用于毛细管电泳芯片分析等位基因特异的基于PCR的单核苷酸多态性分型，并通过检测C282Y多态性证明该系统可以用于遗传性血色素沉着病的诊断。鞘液流动设计最大限度减少了来自检测系统电泳电位的干扰。与光学检测系统不同，电化学检测器更容易小型化，因为不需要庞大的光学元件（即光源、透镜和滤光片）。多电极的应用使该系统成为便携式微全分析系统，可以进行复杂混合物的分析。

综上所述可见，传统CE革新了DNA分析，在成功完成人类基因组计划中发挥重要作用；毛细管电泳芯片技术则代表了小型化、快速、自动化和集成分析系统的另一个重要阶段，可以更经济、更快速、更灵敏和更具有选择性的解决复杂的临床分析问题。与传统CE相比毛细管电泳芯片存在一些缺点，如因为分离通道更短导致峰容量更低以及由于芯片焊接材料一般不能使紫外光透过导致无法兼容通用的紫外检测器。但是快速、样品制备和衍生步骤容易整合从而进一步减少分析时间和人力消耗是毛细管电泳芯片的重要优点，而成本和速度则是现代临床分析所关心的重要问题。

尽管目前毛细管电泳芯片仍处于发展的早期阶段，但该技术已经显示在许多临床分析领域的应用价值。与传统技术相比，基于毛细管电泳芯片的分子诊断方法被证明在分析速度、节约成本和检测灵敏度方面具有显著优点。如上所述，已经有相当多的基于毛细管电泳芯片的新应用。随着高度自动化、高通量商业化设备的引入，毛细管电泳芯片可能取代常规分析中许多复杂和较慢的分析系统，成为临床分析的重要设备。

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[2010-05-24收稿，2010-06-20修回]

[本文编辑：韩仲琪]

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