CXCR-4/SDF-1轴在BMSCs向新生小鼠缺氧缺血脑组织定向迁移的潜在机制研究

申明琪 初桂兰*

新生儿缺氧缺血性脑病（Hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是围生期窒息中常见的中枢神经系统疾病，常造成弥漫性、进行性的神经细胞坏死和凋亡，导致患儿死亡或遗留永久性神经系统后遗症[1]。目前仍缺乏有效的针对性治疗手段，而以支持治疗为主的综合疗法往往效果欠佳。骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化潜能，在一定条件下能够诱导分化为神经细胞，发挥神经细胞替代和组织修复功能，为HIBD的治疗带来了曙光[2]。但在其临床应用前仍存在较多问题，如BMSCs定向诱导分化的调控机制、定向迁移机制等[3,4]。本研究着重观察BMSCs是否存在向HIBD脑组织的定向迁移能力，并初步分析CXCR-4/SDF-1轴在细胞定向迁移过程中可能发挥的作用机制，为临床应用BMSCs治疗HIBD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与动物

胎牛血清（杭州四季青），DMEM培养基、胰蛋白酶（Corning公司）；FITC标记抗体CD29、CD34、CD71和CD105（Serotec公司），兔抗大鼠CXCR-4抗体（北京中杉公司），ELISA试剂盒（武汉博士德公司）；清洁级7日龄SD大鼠幼鼠20只，随机分为正常对照组和HIBD组，每组10只，以及2周龄SD大鼠幼鼠4只，由天津市放射研究所动物中心提供，动物合格证号：SCXK（津）2005-0001。

1.2 BMSCs培养与鉴定

2周龄大鼠幼鼠颈部脱臼处死，75%酒精浸泡15min，无菌条件下分离双侧股骨，剪开干骺端，用1mL注射器抽取DMEM完全培养液反复冲洗骨髓腔，制成单细胞悬液，移入25mL塑料培养瓶中，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，48h后首次半量换液，此后每3d全量换液，3～4次传代后逐渐去除混杂细胞，得到纯化BMSCs后可用于后续试验研究。取生长状态良好的第4代BMSCs，充分悬浮后制成单细胞悬液，FITC标记CD29、CD34、CD71、CD105抗体室温避光染色30min，流式细胞仪和CELLQuest软件采样分析实验结果。

1.3 HIBD模型的制备

HIBD组大鼠按RICE法[5]制作HIBD模型。正常对照组只分离颈总动脉，不结扎，也不予缺氧。

1.4 脑组织匀浆上清液制备

造模后24h冰冻麻醉后处死各组大鼠，无菌条件下取出左右大脑，置冰上，迅速称重，加入DMEM培养基，匀浆，4℃以12 000r /min，离心15min，收集上清。

1.5 Transwell实验检测细胞迁移能力

分正常脑组织对照组和HIBD裂解液组。胰酶消化后收集细胞悬液，取约1×104个BMSCs种植于Transwell上室，下室为对照组和HIBD裂解液组脑组织匀浆上清液，48h后取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，苏木素染色，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。

1.6 ELISA方法检测上清液中SDF-1表达

加0.1mL待检样品于反应孔中，置37℃孵育1h后洗涤，于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1mL，37℃孵育0.5h，洗涤，加入临时配制的TMB底物溶液0.1mL，37℃10min，加入2mol/L硫酸0.05mL。在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

1.7 细胞免疫组化方法检测BMSCs中CXCR-4的表达

4%多聚甲醛固定，Triton X-100处理后，PBS平衡，山羊血清封闭30min；甩去血清，滴加1∶200稀释的抗体工作液，湿盒中4℃过夜；加入FITC荧光标记二抗，hoechst33258复染，PBS和去离子水漂洗后，封片剂封片，荧光显微镜观察。

1.8 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行方差分析和组间比较，P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSCs原代培养与鉴定

原代贴壁细胞成分复杂，随着传代次数增加，异种细胞逐渐被淘汰，于第4代可获得形态均一的纯化BMSCs，细胞呈长梭形或纺锤形，漩涡状排列（图1）；流式细胞仪检测结果显示BMSCs阳性标志蛋白CD29、CD71和CD105表达率分别为98.14%、99.12%和98.77%，阴性标志蛋白CD34表达率为1.19%，符合BMSCs特征。

图1 第4代大鼠BMSCs形态较均一，呈长梭形或纺锤形，漩涡状排列（A×400，B×200）

2.2 Transwell实验检测结果

当下室为对照组即正常脑组织匀浆上清液时，上室培养的BMSCs仅表现出较低的细胞迁移能力，细胞迁移率为（4.71±0.51）%；但当下室为HIBD裂解液时，上室培养的BMSCs表现出较对照组明显增强的细胞迁移能力，细胞迁移率为（35.74±3.73）%（P＜0.05）（图2）。

图2 棉签擦拭以后Transwell小室底面所见（×200）

2.3 ELISA检测结果

正常脑组织匀浆液中SDF-1含量较低，为（11.25±2.11）ng/mL，而HIBD裂解液中SDF-1的含量为（43.24±4.17）ng/mL，两组间比较有统计学差异（P＜0.01），见图3。

2.4 CXCR-4的表达

胞质棕黄色示为CXCR-4表达阳性。当BMSCs浸润在正常脑组织匀浆液中时仅见极低程度的CXCR-4表达，但当其浸润在HIBD裂解液中时CXCR-4表达水平明显提高，两组间比较有统计学差异（P＜0.05），见图4。

3 讨 论

图3 ELISA检测SDF-1表达水平

图4 免疫细胞化学方法检测CXCR-4在BMSCs中的表达

HIBD是围生期婴儿窒息常见的中枢神经系统疾病，缺氧缺血诱导的脑损伤致神经元弥漫性、进行性坏死和凋亡，重度者往往导致患儿死亡，即使存活仍可能遗留永久性神经系统后遗症，如癫痫、脑瘫、智力低下等。目前仍缺乏有效的针对性治疗手段，主要采取以支持治疗为主的综合疗法，但效果往往欠佳。近年来干细胞在中枢神经系统疾病中的应用越来越多，如神经退行性疾病、脑创伤等。最初这方面的研究多局限于神经干细胞，但由于体内神经干细胞数量有限，不易于原代分离培养和长期体外扩增。BMSCs是存在于骨髓中明显区别于造血干细胞的一类前体细胞，它具备明显的自我复制更新和多分化潜能，且因其在体外容易获得和扩增，相较于胚胎干细胞、脐血干细胞，伦理学限制较少，易于实验室工作的大范围展开。近年来围绕BMSCs的研究越来越多，但将其应用于HIBD的移植治疗性研究并不多见。本文就此展开初步研究。

作为一种来源于中胚层的成体干细胞，BMSCs具有向损伤组织、缺血区域定向迁移的能力，称之为“归巢”（homing），这种“归巢”特性是体内干细胞修复损伤或替代坏死结构的基础。目前关于干细胞的趋向性机制还不是很清楚，研究主要着眼于组织间各种生长因子或趋化因子[6]。Son等[7]在研究中发现，当周围环境中的SDF-1和肝细胞生长因子升高时，干细胞表面CXCR4的受体数量明显增加，且具有剂量依赖性。趋化因子在其他类型的干细胞迁移中作用的研究已有报道，例如CXCL-12及其受体CXCR-4 在骨髓的记忆、迁移、归巢造血干细胞中起重要作用[8]。体外条件下趋化因子CXCL-8可趋化BMSCs迁移，封闭趋化因子受体CXCR-1后，其趋化迁移作用明显减弱[9]。程鹏等[10]通过Transwell体系证实干细胞因子可以趋化BMSCs 发生定向迁移，这一迁移过程的细胞内信号转导与p38MAPK通路有关。

本研究采用Transwell体外迁移模型证实BMSCs具有向缺氧缺血性脑组织定向迁移的能力，且向HIBD脑组织迁移能力高于正常脑组织裂解液（P＜0.01）。考虑可能因为脑缺氧缺血后分泌的诱导因子的种类和多少以及BMSCs表面受体与不同趋化因子作用的强弱等诸多因素有关。在接下来BMSCs向HIBD脑组织裂解液定向迁移可能存在的机制中我们发现，正常脑组织匀浆液中SDF-1含量较低，而HIBD裂解液中SDF-1的含量则明显高于对照组，两组间比较有统计学差异（P＜0.01）；同时当BMSCs浸润在正常脑组织匀浆液中时仅见极低程度的CXCR-4表达，但当其浸润在HIBD裂解液中时CXCR-4表达水平明显提高，两组间比较有统计学差异（P＜0.05）。

上述研究结果提示，CXCR-4/SDF-1轴在BMSCs向HIBD损伤脑组织定向迁移过程中可能扮演了重要角色。考虑在机体内复杂的病生理作用环境中常存在其他多个相互作用因子和元件，因此有关于BMSCs向HIBD损伤脑组织定向迁移的具体机制有待于进一步拓展和深入。

[1]Abend NS,Licht DJ. Predicting outcome in children with hypoxic ischemic encephalopathy[J].Pediatr Crit Care Med,2008,9(1):32.

[2]徐如祥.中枢神经系统损伤后神经再生的策略[J].中华神经医学杂志,2007,6 (2):109-112.

[3]Deng J,Petersen BE,Steindler DA,et al.Mesenchymal stem cells spontaneously express neural proteins in culture and are neurogenic after transplantation[J].Stem Cells, 2006,24(4):1054-1064.

[4]Mankani MH,Kuznetsov SA,Shannon B,et al. Canine cranial reconstruction using autologous bone marrow stromal cells [J].Am J Pathol,2006,168(2): 542.

[5]Rice JE,Vannucci RC,Brierley JB.The inf l uence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat [J].Ann Neurol,1981,9(2):131.

[6]Schönemeier B,Kolodziej A,Schulz S,et al. Regional and cellular localization of the CXCl12/SDF-1 chemokine receptor CXCR7 in the developing and adult rat brain[J]. J Comp Neurol,2008,510(2):207-220.

[7]Son BR,Marquez-Curtis LA,Kucia M,et al. Migration of bone marrow and cord blood mesenchymal stem cells in vitro is regulated by stromal-derived factor-1-CXCR4 and hepatocyte growth factorc-met axes and involves matrix metalloproteinases[J]. Stem Cells,2006,24(5):1254–1264.

[8]Levesque JP,Hendy J,Takamatsu Y,et al . Disruption of t he CXCR4/CXCL12 chemotactic interaction during hematopoietic stem cell mobilization induced by GCSF or cyclophosphamide[J]. J Clin Invest,2003,111 (2) :187.

[9]李兴泽,孟庆海,金澎,等.趋化因子CXCL-8趋化骨髓间充质干细胞迁移的体外效应[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(10):1908.

[10]程鹏,高志强,刘云会,等.干细胞因子对骨髓间充质干细胞定向迁移的影响[J].中国现代医学杂志,2009,19(2)224.