高血压病和2型糖尿病患者血清损伤ECV－304细胞的比较研究*

周永红， 陈利国△， 屈 援， 唐海兰， 程少冰

(暨南大学1医学院中医系，2管理学院，3实验技术中心，广东 广州 510632)

中医研究发现，高血压病和2型糖尿病中均表现出血瘀证［1－4］的证候，说明在临床上存在“异病同证”，但其病理生理基础尚需进一步研究。体外培养的人脐静脉内皮细胞和体内重要器官血管内皮的功能有相似性［5］，本研究在前期建立2型糖尿病血瘀证血管内皮细胞损伤模型的基础上［3］，进一步观察高血压病和2型糖尿病血瘀证患者血清损伤ECV－304细胞后造成的细胞形态、细胞活性、细胞内分泌功能、细胞内游离钙浓度和骨架微丝分布的变化，对比不同疾病的血瘀证细胞损伤模型的差异，以探讨中医“异病同证”的病理生理学基础，为血瘀证的证候实质研究提供相关依据。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞来源 ECV－304细胞购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.2 病人资料 (1)2型糖尿病血瘀证组:选取2005年9月－2006年8月暨南大学附属第一医院内分泌科、中医科和神经内科住院的患者40例，符合WHO1999年［6］和 ADA2003年“2型糖尿病”诊断标准［7］和1986年修订的血瘀证诊断标准［8］。平均年龄(68.4±7.3)岁。(2)高血压病血瘀证组:为同期暨南大学附属第一医院心血管科、中医科和神经内科就诊及健康体检的老年新近诊断为高血压病(1－2级)且未使用降压药物的病例的患者40例，诊断标准按照美国JNC7指南的诊断标准(收缩压≥140 mmHg且舒张压 ＜ 90 mmHg)［9］和血瘀证诊断标准［8］。其中，按血压级别分为:1级高血压患者8例，2级高血压患者32例，平均年龄(70.7±4.1)岁。所选病例能较好地代表血瘀证的各种兼证的临床分布情况。2组患者均排除心、脑、肾等并发症，2组患者的性别分布和平均年龄无显著差异(P＞0.05)，具有可比性。

1.3 血清制备收集 空腹取血，自凝后4℃、2000 r/min离心15 min，取上清液置无菌EP管中，56℃灭活30 min，－20℃冻存，备用。

1.4 试剂 胰蛋白酶、噻唑蓝(thiazolyl blue，MTT)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自Sigma。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。DMEM培养基、Triton X－100和牛血清白蛋白(BSA)购自Gibco。内皮素(endothelin，ET)放免试剂盒购自北京普尔伟业生物科技有限公司。一氧化氮(nitric oxide，NO)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。内皮细胞蛋白C受体(endothelial cell protein C，EPCR)、血管性假性血友病因子(von Willabrand factor，vWF)和血栓调节蛋白(thrombomodulin，sTM)酶联免疫定量检测(ELISA)试剂盒均购自ADL。Fluo－3/AM购自Bio－Rad。罗丹明标记的鬼笔环肽(Rhodamine phalloidin)购自 Invitiogen(300 U，货号 R415)。Hoechst 33258购自华美生物工程公司。Phtri皿为Corning。激光共聚焦显微镜为Carl Zeiss。

2 方法

2.1 MTT法观察细胞活性［10］将内皮细胞以5×107cells/L的浓度种入96孔培养板，进行分组干预。糖尿病血瘀证组加入10%浓度的糖尿病血瘀证患者血清，高血压病血瘀证组加入10%浓度的高血压病血瘀证患者血清，对照组则加入等量的DMEM。继续培养24 h。终止干预后予PBS洗去培液，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，孵育4 h，倾去上清液，加 DMSO 150 μL，振荡10 min，使蓝紫色结晶充分溶解。全自动酶标仪于570 nm处测定吸光度值。

2.2 光镜和电镜下细胞形态学观察 按照1×108cells/L的密度接种于6孔培养板，每孔2 mL细胞悬液。用含10%FBS的DMEM培养24 h后，观察大部分细胞相互融合形成单层，细胞呈现卵石状排列，弃培养液，换无血清培养液进行饥饿，24 h后换新培养液，血清干预方法同前。继续培养24 h。倒置相差显微镜下观察并拍照。

按照2×107cells/L的密度将细胞种植在6孔培养板中的盖玻片上，干预方案同前，经过固定、洗涤、脱水、加乙酸异戊酯和CO2临界点干燥等程序后，扫描电镜下观察和拍片。

按照1×108cells/L的密度将细胞接种在25 mL培养瓶中，干预方案同前，经过固定、漂洗、梯度脱水、渗透和包埋、固化、超薄切片和染色等程序后，透射电镜下观察和拍片。

2.3 各组血清对细胞内分泌功能的影响 NO检测利用硝酸还原酶法，ET检测利用非平衡法，EPCR检测、vWF检测和sTM检测均采用ELISA法，于波长450 nm的酶标仪上读取各孔的A值，以A值为自变量(Y)，以标准品的浓度为因变量(X)，通过曲线拟合的方法求出标准曲线方程。

2.4 共聚焦显微镜下观察细胞内游离钙浓度 按照1×108cells/L将细胞种植在Petri皿中，干预方法同前;终止干预后予PBS冲洗2次，10 μmol/L Fluo－3/AM加于Petri皿，37℃培养箱中培养30 min;取出Petri皿，用PBS冲洗后置于激光共聚焦显微镜下进行观察。Fluo－3/AM的激发波长为488 nm，发射波长为525 nm，Kd值(荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数)在(0.37－2.30)×10－6之间。以上实验均重复6次。

2.5 荧光探针标记的鬼笔环肽染色法观察细胞骨架微丝 按照1×108cells/L将细胞种植在6孔培养板的盖玻片上，干预方法同前;终止干预后37℃的PBS清洗细胞2次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗2次后滴加0.1%Triton X－100放置5 min，PBS清洗后用5%BSA孵育细胞30 min，加入荧光探针标记的鬼笔环肽染色，避光室温放置2 h，PBS清洗细胞后滴加1%Hoechst，避光室温放置10 min，PBS清洗细胞后缓冲甘油封片，－20℃冰箱冻存。激光共聚焦显微镜下观察。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件分析，计量资料数据以均数±标准差()表示。多组间比较采用单因素方差分析。

结 果

1 血清损伤后细胞活性变化结果

MTT结果显示:10%血清作用下，高血压病血瘀证组的细胞活力低于对照组(P＜0.05)，糖尿病血瘀证组的细胞活力也低于对照组(P＜0.05)，但高血压病血瘀证组的细胞活力与糖尿病血瘀证组无显著差异(P＞0.05)。

表1 各组血清对细胞活性的影响Table 1.Effect of the sera of patients with hypertension and type 2 diabetes mellitus on viability of ECV－304 cells(.n=8)

表1 各组血清对细胞活性的影响Table 1.Effect of the sera of patients with hypertension and type 2 diabetes mellitus on viability of ECV－304 cells(.n=8)

*P ＜0.05 vs control.

Control 1.51 ±0.16 sera from patients with T2DM 0.88 ±0.11*sera from patients with hypertension 0.98 ±0.12*

2 血清损伤后细胞形态观察

倒置相差显微镜下观察空白对照组细胞呈现典型血管内皮细胞形态;糖尿病血瘀证组中细胞间隙增宽，部分轮廓不清，碎片较多;高血压病血瘀证组形态与糖尿病血瘀证组类似，见图1。

Figure 1.Morphology of ECV －304 cells under inverted phase contrast microscope(×200).A:control;B:sera from patients with T2DM;C:sera from patients with hypertension.图1 倒置相差显微镜下各组细胞的形态

扫描电镜下观察空白对照组细胞呈现椭圆形，细胞表面有丝状突起;糖尿病血瘀证组细胞明显变形，有的收缩分离成为放射星状体，表面有大小不一的圆形凹陷或突起;高血压病血瘀证组细胞变形，有的细胞之间有指状突起相连接，表面有大小不一的圆形凹陷或突起，见图2。

Figure 2.Morphology of ECV －304 cells under scanning electron microscope(×5000).A:control;B:sera from patients with T2DM;C:sera from patients with hypertension.图2 扫描电镜下各组细胞的表面结构

透射电镜观察空白对照组细胞表面微绒毛丰富，粗面内质网、核糖体、平面内质网、线粒体双层膜及内嵴结构清晰，核形态为圆形，见核仁;糖尿病血瘀证组细胞表面有少量微绒毛，胞浆内吞饮泡较多，大小不一。粗面内质网较少并扩张，核糖体部分丢失。平面内质网扩张呈现空泡状，线粒体模糊不清，嵴消失，核未见特殊改变;高血压病血瘀证组细胞形态与糖尿病血瘀证组类似，见图3。

Figure 3.Morphology of ECV－304 cells under transmission electron microscope.A:control(×30000);B:sera from patients with T2DM(×24000);C:sera from patients with hypertension(×15000).图3 透射电镜下细胞的超微结构观察

3 血清损伤后细胞内分泌功能变化

高血压病血瘀证组的ET水平高于对照组(P＜0.05)，糖尿病血瘀证组也高于对照组(P﹤0.05)，且高血压病血瘀证组的ET水平低于糖尿病血瘀证组(P＜0.05);高血压病血瘀证组的NO水平低于对照组(P＜0.05)，糖尿病血瘀证组也低于对照组(P＜0.05)，且高血压病血瘀证组的NO水平高于糖尿病血瘀证组(P＜0.05)，高血压病血瘀证组的EPCR、vWF和sTM含量高于对照组(P＜0.05)，糖尿病血瘀证组也高于对照组(P＜0.05)，且高血压病血瘀证组的EPCR水平低于糖尿病血瘀证组(P＜0.05)，而高血压病血瘀证组的vWF和sTM含量与糖尿病血瘀证组之间无显著差异(P＞0.05)。以上均见表2。

表2 各组细胞内分泌功能变化Table 2.Changes of ET，NO，EPCR，vWF and sTM expression in ECV－304 cells incubated with the sera of patients with hypertension and T2DM(.n=8)

表2 各组细胞内分泌功能变化Table 2.Changes of ET，NO，EPCR，vWF and sTM expression in ECV－304 cells incubated with the sera of patients with hypertension and T2DM(.n=8)

*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs sera from patients with T2DM.T2DM:type 2 diabetes mellitus.

Group ET(nmol/L) NO(μmol/L) EPCR(mg/L) vWF(%) sTM(μmol/L)Control 77.88 ±10.07 52.97 ±8.51 113.94 ±16.04 51.09 ±9.92 18.47 ±2.59 Sera from patients with T2DM 286.03 ±24.03* 22.37 ±3.30* 189.66 ±11.76* 79.94 ±8.52* 29.25 ±5.16*Sera from patients with hypertension 177.62 ±15.77*# 32.61 ±6.76*#168.32 ±21.94*#80.17 ±10.25* 28.36 ±4.94*

4 血清损伤后对胞内游离钙浓度的影响

高血压病血瘀证组［Ca2+］i高于对照组(P＜0.05)，糖尿病血瘀证组［Ca2+］i高于对照组(P＜0.05)，见表3。高血压病血瘀证组［Ca2+］i高于糖尿病血瘀证组(P＜0.05);表现在胞浆中的荧光分布不均匀，呈网状或团块状，见图4。

Figure 4.Changes in［Ca2+］iof ECV －304 cells under laser scanning confocal microscope(×600).A:control;B:sera from patients with T2DM;C:sera from patients with hypertension.图4 激光共聚焦显微镜下各组细胞的［Ca2+］i荧光图像

表3 各组细胞内游离钙浓度比较Table 3.Changes of intracellular free calcium concentration(［Ca2+］i)in ECV－304 cells incubated with the sera of patients with BSS associated with hypertension and T2DM(.n=48)

表3 各组细胞内游离钙浓度比较Table 3.Changes of intracellular free calcium concentration(［Ca2+］i)in ECV－304 cells incubated with the sera of patients with BSS associated with hypertension and T2DM(.n=48)

＊P＜0.05 vs sera from patients with T2DM.

Group ［Ca2+］i(fluorescence intensity)Control 92.05 ±6.42 Sera from patients with T2DM 127.53 ±10.48*Sera from patients with hypertension 156.78 ±8.22*

5 血清损伤后对细胞骨架微丝的影响

对照组细胞骨架微丝分布规则，彼此连接，附着在细胞内特定部位，呈丝网状有序排列;糖尿病血瘀证组可见细胞外形皱缩，间隙加大，微丝断裂，排列紊乱，少部分区域缺失，微丝收缩变短或移向周边，丝网状有序排列消失;高血压病血瘀证组可见细胞间隙加大，微丝全部断裂，排列紊乱，大部分微丝收缩成团，少部分微丝缺失出现空隙，见图5。

Figure 5.Cytoskeleton of ECV－304 cells under laser scanning confocal microscope(×400).A:control;B:sera from patients with T2DM;C:sera from patients with hypertension.图5 激光共聚焦显微镜下各组细胞的骨架微丝分布

讨 论

证候模型是中医药实验研究的重要工具，利用证候模型来研究中医基础理论及临床疗效，可以为中医学的研究和发展提供科学依据［11］。我们在前期建立糖尿病血瘀证血管内皮细胞损伤模型的基础上［3］，针对高血压病血瘀证血管内皮细胞损伤模型和糖尿病血瘀证血管内皮细胞损伤模型进行比较研究，以明确在特定环境下细胞内部发生的共同变化机制。因此我们应用前期较为成熟的技术如血管损伤标志物、胞内游离钙浓度和细胞骨架微丝来揭示异病同证的共性，寻找出血瘀证中某些具有普遍意义的最基本的客观指标，为病证结合细胞模型的深入研究提供实验和理论基础。

实验中我们观察到高血压病血管内皮细胞损伤模型和2型糖尿病血瘀证血管内皮细胞损伤模型都存在不同程度的内皮功能障碍，与人体中内皮细胞所处的解剖部位是一个易损伤的功能性界面有关，各种损伤刺激和心血管危险因素都首先作用于此，导致功能的降低和紊乱［12］。正是由于出现内皮功能障碍的作用机制有相同之处，表现在细胞形态和细胞活性、细胞内分泌功能(vWF和TM)等方面没有明显的差异，此为“证”同，可以作为“血瘀证”共同的病理生理学基础模型。而在异“病”方面，由于糖尿病和高血压病的发病机制不同，临床表现各异，尤其高血压病涉及到血脂异常，服用药物等因素，所以二者的血清也在不同程度上存在差异，因而造成血管内皮细胞损伤的程度也不同，例如细胞内分泌功能(EPCR、ET和NO)、细胞内钙离子的浓度等，此一点有可能作为“病”异的基础，前后结合后则明确体现了异“病”同“证”的特点，深入机制探讨将有可能对血瘀证的微观辨证提供依据。

另外，我们在以往的研究曾经讨论过，细胞内钙离子的升高可能介导了血瘀证血清对细胞骨架的损伤作用［13］。此次的研究中也证实了这点，细胞内钙离子浓度高的高血压病血瘀证组在细胞骨架微丝的分布上与空白对照组差异最大，此一点也可以解释“异病同证”的血管内皮细胞损伤模型在细胞骨架微丝上的差异。

［1］韩学杰，朱 妍，陈 捷，等.原发性高血压病痰瘀互结、毒损心络中医证类的临床流行病学调查研究［J］.中国中医基础医学杂志，2008，14(6):453－455.

［2］王文智，徐树楠，徐伟超.高血压病血瘀证机理研究述评［J］.中医杂志，2007，48(6):560 －562.

［3］周永红，陈利国，屈 援，等.2型糖尿病血瘀证血管内皮细胞损伤模型的研究［J］.北京中医药大学学报，2009，32(11):742 －746，754.

［4］刘敬顺，姜 燕，安晓飞，等.血清糖基化终产物CML与2型糖尿病血瘀证患者微血管病变危险因素的相关性研究［J］.江苏中医药，2010，42(2):16 －18.

［5］陈利国，胡小勤.论病证结合血瘀证血管内皮细胞损伤模型的建立［J］.中国中西医结合杂志，2007，27(3):271－273.

［6］钱荣立.关于糖尿病的新诊断标准与分型［J］.中国糖尿病杂志，2000，8(1):5 －6.

［7］Genuth S，Alberti KG，Bennett P，et al.Follow－up report on the diagnosis of diabetes mellitus［J］.Diabetes Care，2003，26(11):3160 －3167.

［8］中国中西医结合研究会活血化瘀专业委员会.血瘀证诊断标准［J］.中西医结合杂志，1987，7(3):129.

［9］Chobanian AV，Bakris GL，Black HR，et al.Seventh report of the Joint National Committee on prevention，detection，evaluation，and treatment of high blood pressure［J］.Hypertension，2003，42(6):1206－1252.

［10］陈 平，章永平，乔敏敏，等.活化蛋白C对脂多糖诱导的人脐静脉血管内皮凋亡的影响研究［J］.中国病理生理杂志，2008，24(2):270 －274.

［11］田金洲，王永炎，时 晶，等.证候模型研究的思路［J］.北京中医药大学学报，2005，28(6):18－21.

［12］Hirsch AT.Vascular disease，hypertention and prevention:“form endothelium to clinical events”［J］.JACC，2003，42(2):377－379.

［13］周永红，陈利国，屈 援，等.2型糖尿病患者对人脐静脉内皮细胞骨架及胞浆内游离钙的影响［J］.中国老年学杂志，2009，29(15):1865 －1867.