前列腺特异的转录因子NKX3.1上调Dicer1基因的表达*

张 菊， 关恒云， 张鹏举， 陈蔚文， 陈兆波， 倪娜娜， 朱闻捷，王 坤， 胡小燕， 姜安丽△

(山东大学1医学院生物化学与分子生物学研究所，2医学院，山东 济南 250012)

同源盒基因(homeobox genes)最早在果蝇中发现，是一类编码同源域蛋白调控胚胎发育分化的基因。NKX3.1是从小鼠基因组克隆出的新的同源盒基因NK家族成员，位于鼠的14号染色体。人类的同源盒基因 NKX3.1，定位于8p21［1］，长度为3.5 kb，有2个外显子，第2个外显子含有同源框序列。NKX3.1在功能上属于核转录因子，特异亲和的序列为TAAGAA［2］。研究表明NKX3.1基因在前列腺上皮及前列腺癌组织特异表达，并与前列腺癌的进展、转型有关，可能作为抑癌基因发挥作用［3］。

Dicer首先也是在果蝇中发现的，由DCR基因编码。在果蝇中有Dcr－1，Dcr－22种亚型，但在人类只有Dicer1基因［4］。人的Dicer1基因定位于染色体14q32.13，全长52.3 kb，包括28个外显子和27个内含子。Dicer1编码蛋白属于RNaseⅢ家族［5］，在许多组织中广泛表达，在miRNA的成熟过程中起着重要的作用。miRNA是一类长度很短的非编码单链小分子RNA，参与体内多种代谢过程，包括细胞分化、生物发育、癌症等［6］。miRNA let－7a是 miRNA 家族中已发现的成员之一，包括miRNA let－7a－1、miRNA let－7a－2、miRNA let－7a－3［7］。最近研究显示miRNA let－7a－1在多种肿瘤，包括前列腺癌中表达是下调的，与肿瘤的发生、发展密切相关［8］。

本研究采用基因芯片检测NKX3.1对前列腺癌细胞基因表达谱的影响，发现NKX3.1可上调前列腺癌细胞中Dicer1基因的表达，进一步通过RTPCR和Western blotting检测证实 NKX3.1可上调Dicer1基因表达。为了检测成熟miRNA let－7a－1作用，构建了miRNA let－7a－1靶序列－报告基因重组质粒。同时将miRNA let－7a－1靶序列－报告基因重组质粒转染前列腺癌细胞PC3细胞和PC3(+)细胞中，结果显示，PC3(+)细胞中荧光素酶活性明显下降，表明Dicer1基因能有效促进miRNA let－7a－1的成熟，成熟的miRNA let－7a－1结合靶序列后，抑制了报告基因荧光素酶活性表达。为今后进一步探讨NKX3.1上调Dicer1的具体机制及其miRNA let－7a－1在前列腺癌中作用奠定了基础。

材料和方法

1 材料

质粒 pcDNA3.1(+)(本实验室构建)［9］、Trizol试剂购自Invitrogen;质粒pMIR－reportTM购自Ambion;限制性内切酶、Taq酶、PCR试剂盒购于大连宝生物工程公司;M－MLV逆转录酶购自Fermentas;前列腺癌PC3细胞株购自中科院上海细胞所;鼠抗人Dicer1抗体购自Zamed，羊抗鼠lgG购于北京中杉金桥公司;RPMI－1640培养基购于Gibco;基因组芯片，上海康成生物有限公司;其余试剂为国产分析纯。

2 方法

2.1 PC3稳转细胞系的构建 前列腺癌PC3细胞以1×107cells/L接种于24孔板中，当细胞汇合至约90%时，将 NKX3.1真核表达载体 pcDNA3.1－NKX3.1纯化定量后用FuGENE®HD试剂转染前列腺癌PC3细胞，对照组转染pcDNA3.1空载体。转染24 h后，换用200 mg/L G418的 RPMI－1640筛选，10－14 d后可见阳性克隆，有限稀释法克隆培养获得NKX3.1稳定转染的前列腺癌PC3细胞，稳定转染pcDNA3.1－NKX3.1的前列腺癌PC3细胞命名为PC3(+)。

2.2 基因芯片检测 分别用Trizol试剂提取PC3细胞和PC3(+)细胞总RNA。对样品RNA进行荧光标记，取 10 μg RNA，以 T7 －Oligo(dT)5'－AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATAGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV－3'为引物(V可以是 G、C和A)，用cDNA synthesis kit合成双链cDNA。双链合成以后用QIAquick PCR purification kit(Qiagen)纯化;用T7 riboMAX express large scale RNA production system(Promega)将双链cDNA进行体外转录合成cRNA;然后用RNeasy mini kit(Qiagen)纯化;随机引物反转录。取2 μg cRNA，用 superscriptⅡ反转录酶20×108U/L(Invitrogen)，9 random primer进行反转录，反转录产物用QIAquick PCR purification kit(Qiagen)纯化;取2 μg cRNA反转录产物，以6 random primer为引物进行Klenow标记，标记产物用QIAquick PCR purification kit(Qiagen)纯化，纯化后抽干。标记过程中 dATP、dCTP、dGTP、dTTP使用浓度为 120 μmol/L，dCTP 使用浓度为 60 μmol/L，Cy5－dCTP、Cy3 －dCTP 使用浓度为 40 μmol/L。在本实验中，PC－3细胞的cDNA用Cy5荧光素酶标记，PC－3(+)细胞的cDNA用Cy3荧光素酶标记。标记的DNA溶于30 μL杂交液中(3×SSC，0.2%SDS，5×Denhart’s，25%甲酰胺)，于42 ℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2%SDS、2×SSC的液体中洗5 min，而后在0.2×SSC中室温洗5 min。玻片甩干后即可用于扫描。扫描芯片用ScanArray Express双通道激光扫描仪(Packard Bioscience)进行。采用GenePix Pro 4.0图像分析软件(Axon Instruments)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号;然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化;最后以差异为2倍的标准来确定差异表达基因。

2.3 RT－PCR检测 Dicer1 mRNA表达 根据Dicer1序列设计引物，上游引物(F)序列为:5'－CT-CAGCCATGTGAGATTGTG －3'，下游引物(R)序列为:5'－GTCCCAGAACTACCAATACG－3'。用 Trizol一步法提取人前列腺癌PC3细胞和PC3(+)细胞总RNA，用随机6聚体引物和M－MLV逆转录酶将细胞总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，以Dicer1 F和 Dicer1 R为引物，PCR扩增 Dicer1基因。PCR 条件:94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃20 s，28个循环，最后72℃ 10 min。

2.4 Western blotting检测Dicer1蛋白表达 用细胞裂解液［50 mmol/L Tris－ HCl(pH8.0)，150 mmol/L NaCl，0.1%SDS，1%NP － 40，100 mg/L PMSF］收集PC3细胞和PC3(+)细胞总蛋白，BCA法蛋白定量后，按30 μg上样电泳，Westhern blotting检测Dicer1蛋白表达，Ⅰ抗为1∶1000稀释的鼠抗人Dicer1，Ⅱ抗为1∶2000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，以β－actin为内参照，加ECL显色剂显色，暗室中曝光X光观察。

2.5 miRNA let－7a－1靶序列－报道基因融合质粒的构建 根据miRBase Targets数据库查找hsa－let7a－1靶序列(UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU)，人工合成其DNA序列及其互补序列，两端分别加HindⅢ和SacⅠ酶切位点，7a1TF 5'－agcttTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTgagct－3';7a1TR 3'－aACTCCATCATCCAACATATCAAc－5'。等摩尔比混合2条链，95℃加热5 min后，自然冷却至室温。将退火双链克隆到pMIR－reportTMluciferase载体中构成miRNA let－7a－1靶序列－报道基因融合质粒 pMIR－reportlet7a－1T。限制性内切酶MluⅠ酶切及测序鉴定阳性重组体。pMIR－reportTMluciferase vector中内切酶MluⅠ的切点位于片段插入处HindⅢ和SacⅠ切点之间。

2.6 细胞培养及转染实验 前列腺癌PC3细胞和PC3(+)细胞分别接种于24孔板，用含10%小牛血清、1×105U/L青霉素及1×105U/L链霉素的RPMI－1640培养基，37℃、5%CO2条件下培养。当细胞融合度﹥80%时，换用无抗生素RPMI－1640培养基，用FuGENE®HD试剂转染细胞(4复孔)，每孔1μL FuGENE® HD+0.5 μg pMIR － report－ let7a1T+0.05 μg pMIR － report β － gal control+25 μL opti－MEM。对照组转染等剂量 pMIR－reportTMluciferase空载体。

2.7 荧光素酶活性测定 按试剂盒(Promega)说明进行，弃掉细胞培养基，PBS冲洗细胞1次，加入1×RLB裂解液，放置室温10 min后，吹打细胞，收集细胞裂解液。荧光素酶活性测定:荧光测定管中加100 μL LARⅡ(luciferase assay reagent)，再加细胞裂解液20 μL，放置发光仪中，测定pGL3中的firefly荧光素酶活性，读数为M1。β－半乳糖苷酶活性测定:30 μL细胞裂解液+20 μL 1×RLB裂解液+50 μL 2×AB检测缓冲液，37℃保温30 min，加150 μL 1 mol/L碳酸钠终止反应，420 nm检测，计算得到的β－半乳糖苷酶活性为M2。用M1/M2比值表示相对荧光素酶活性。

3 统计学处理

结 果

1 芯片结果

结果显示，Dicer1基因在前列腺癌PC3细胞和PC3(+)细胞表达有明显差异，Cy3/Cy5的比值为3.59，见图1。

Figure 1.The differential expression of Dicer1 in PC3(+)and PC3 cells detected by gene chip..n=3.*P＜0.05 vs PC3 cells.图1 基因芯片检测Dicer1基因在PC3(+)和PC3细胞中的表达

2 NKX3.1对Dicer1 mRNA表达的影响

Dicer1 mRNA在PC3(+)细胞中表达较在PC3细胞的表达明显增加，见图2。

3 NKX3.1对Dicer1蛋白表达的影响

Dicer1蛋白质在PC3(+)细胞中表达较在PC3细胞的表达明显增加，见图3。

4 miRNA let－7a－1靶序列－报道基因融合质粒酶切鉴定及测序

人工合成hsa－let7a－1靶序列的DNA序列及其互补序列，2端分别加HindⅢ和SacⅠ酶切位点。退火克隆到pMIR－reportTMluciferase载体中成功构成miRNA let－7a－1靶序列－报道基因融合质粒pMIR－report－let7a－1T。经MluⅠ酶切pMIR－report－let7a－1T和pMIR－reportTMluciferase空载体后，琼脂糖凝胶电泳结果与预期结果相符，见图4。

Figure 2.The expression of Dicer1 mRNA in PC3(+)and PC3 cells..n=3.*P＜0.05 vs PC3 cells.M:marker;1:PC3(+)cells 2:PC3 cells.图2 Dicer1 mRNA分别在PC3(+)和PC3细胞中表达

Figure 3.The expression of Dicer1 protein in PC3 cell and PC3(+)cell by Western blotting..n=3.*P＜0.05 vs PC3 cells.1:PC3(+)cells;2:PC3 cells.图3 Western blotting检测Dicer1蛋白质在PC3(+)和PC3细胞中表达

Figure 4.Identification of cloned pMIR －report－let7a－1T by restriction enzyme digestion.M:marker;1:pMIR －reportTMluciferase vector digested by MluⅠ;2:pMIR－report－let7a－1T digested by MluⅠ.图4 let－7a－1靶序列－报道基因融合质粒酶切电泳鉴定

5 成熟miRNA let－7a－1对其靶序列的作用

pMIR－report－let7a－1T转染PC3和PC(+)细胞后，相对荧光素酶活性(Ml/M2)分别为14.2和6.4，两者差异显著(P＜0.05)，表明pMIR－reportlet7a－1T转染PC3(+)细胞后，NKX3.1上调Dicer1的表达，有效促进miRNA let－7a－1的成熟。pMIR－reportTMluciferase空载体转染 PC3细胞和 PC3(+)细胞后，M1/M2分别为150.4和150.5，两者没有明显差异，见图5。

Figure 5.The effects of mature let－7a－1 on its target sequence detected by luciferas assay..n=4.*P＜0.05 vs PC3(+)cells in the same group.图5 荧光素酶活性检测成熟let－7a－1对靶序列的作用

讨 论

NKX3.1是前列腺特异表达的同源盒基因，受雄激素调节，其产物在结构与功能上属于核转录因子［10］，具有抑制前列腺上皮生长及维持分化的作用，与前列腺的发育成熟以及前列腺癌的发生发展密切相关［11］。Dicer是RNaseⅢ家族成员，在进化上高度保守［12］。Dicer蛋白为一种约200 kD的多结构域蛋白质，含有5个结构域:1个DexH型ATP依赖的N末端解旋结构域;1个PAZ结构域;2个RNaseⅢ结构域;1个dsRNA结合结构域［13］。Dicer主要凭借其RNaseⅢ结构域发挥作用。研究发现:Dicer1对形成miRNA成熟产物是必需的，其PAZ结构域的作用可能是促进Dicer1与miRNA前体分子结合，对miRNA介导的转录后基因沉默是必不可少的［14］。miRNA分子是一类长约18－25个核苷酸的非编码小分子RNA，在转录后水平通过阻遏局部碱基互补配对的mRNA的翻译而抑制靶基因的表达［15］。miRNA的成熟需要经历3个过程:首先在细胞核中最原始的编码miRNA的基因组DNA转录成miRNA的原始转录物(pri－miRNA)，在Drosha酶作用下生成pre－miRNA;然后pre－miRNA被转运到细胞质;最后，在细胞质中pre－miRNA在Dicer酶作用下被剪切成双链成熟的miRNA。成熟miRNA通过与靶基因mRNA的3'非翻译区结合，抑制mRNA的翻译。

本实验首次报道了NKX3.1上调Dicer1的表达，与miRNA的成熟与功能有密切关联。目前研究表明miRNA表达在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用［16］，可以起到“癌基因”或者“抑癌基因”的功能［17］。miRNA let－7a－1 是目前研究最为广泛的miRNA之一，研究显示miRNA let－7a－1在前列腺肿瘤中表达是下调的，与前列腺肿瘤的发生、发展密切相关。NKX3.1是前列腺特异性同源框基因，目前认为NKX3.1为前列腺特异的抑癌基因，它的缺失或突变，可能是前列腺癌发生和雄激素非依赖等恶性表型的原因［18］。NKX3.1是否通过调节Dicer1表达间接调控miRNA let－7a－1的功能，从而抑制前列腺肿瘤的发生发展?有待于在大量临床标本中进一步实验研究。同时，本实验研究也为前列腺癌的治疗开辟了新途径。

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