IFN－γ与IL－4基因多态性与儿童哮喘易感性及外周血IFN－γ、IL－4和IgE的关系*

黄花荣， 吴敬芳

(中山大学附属第二医院儿科，广东 广州 510120)

支气管哮喘(以下简称哮喘)是儿童期最常见的慢性呼吸道疾病，其发病机制迄今尚未完全阐明。哮喘的本质为气道慢性炎症，免疫学发病机制主要为Thl/Th2反应的失衡，Th1类细胞因子分泌不足，Th2类细胞因子产生增加，进而导致IgE合成增加，直接或间接诱导肥大细胞、嗜酸性粒细胞脱颗粒产生气道高反应及炎症。干扰素－γ(interferon－γ，IFN－γ)、白细胞介素 －4(interleukin－4，IL－4)分别作为Thl、Th2类细胞的特征性细胞因子，在哮喘发病机制中起重要作用［1，2］。目前认为每类细胞因子基因的调控区和启动子区的等位基因不尽相同，等位基因的多态性可能会影响细胞因子的合成，从而造成哮喘发生的免疫机制更加复杂。IFN－γ和IL－4基因作为哮喘的遗传易感基因［3］，能够较完整地从Th1/Th2的角度研究IFN－γ/IL－4细胞因子基因多态性与儿童支气管哮喘的相关性，国内外至今尚未见报道。况且由于人种不同及地区的差异性，基因多态性分布也存在着很大的差异。因此，我们对广东珠三角地区哮喘儿童IFN－γ和IL－4基因多态性进行研究分析，以探讨其与儿童哮喘易感性及外周血IFN－γ、IL－4和总IgE水平的相关关系。

材料和方法

1 材料与仪器

PCR试剂和DNA marker购自宝生物工程有限公司;AvaⅡ和BsmAⅠ内切酶购自NEB(北京)有限公司;PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。IFN－γ和IL－4 ELISA kits购自深圳达科为生物科技有限公司，总IgE ELISA kits购自Bio Check。主要仪器:Bio－Rad DNA Engine PCR仪，Labsystems Dragon Wellscan MK 3型酶标测定仪，Applied Biosystems ABI 3730XL基因分析仪。

2 研究对象

选取2009年3月－2010年2月在中山大学附属第二医院儿科哮喘专科门诊就诊的广东珠三角地区100例哮喘患儿，年龄2－13(6.57±2.76)岁，其中男51例，女49例。选择同期在儿科保健门诊体检的健康儿童及小儿外科病区收治的外伤、骨折等患儿122例为对照组，年龄为3－14(7.46±2.94)岁，其中男70例，女52例。所有对照均无哮喘病史、哮喘家族史、典型过敏性疾病史(包括湿疹、变应性鼻炎、特异性皮炎)及近期感染史。2组儿童在性别构成、年龄分布上无明显差异(P＞0.05)。

3 方法

3.1 标本采集及基因组DNA提取 对所有研究对象均采集外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，先留取300 μL全血用于提取基因组DNA，剩余全血离心分离血浆后分装冻存，用于检测外周血IL－4、IFN－γ和总IgE含量。取全血300 μL用OMEGA基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，紫外分光光度仪检测其浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，提取的DNA放置－20℃保存备用。

3.2 IFN－γ基因－179G/T、IL－4基因 －33C/T和－589C/T位点多态性检测 采用聚合酶链反应－限制性酶切片段长度多态性(polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR －RFLP)技术检测，各位点PCR引物序列、退火温度、PCR产物大小及限制性内切酶见表1［4－6］。PCR扩增:PCR反应条件:95℃预变性4 min，95℃ 40 s，退火40 s(温度见表1)，72℃ 40 s，共35个循环，72℃8 min，4℃保存。限制性内切酶酶切反应:酶切反应体系 20 μL，置于 37℃(AvaⅡ内切酶)或 55℃(BsmAⅠ内切酶)水浴消化6 h。酶切产物分析与基因型鉴定:依照酶切产物片段大小选取不同的电泳方法，如琼脂糖凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。观察酶切后电泳凝胶图像，以DNA marker为内参照，确定各研究对象基因型。各位点酶切后不同片段长度对应基因型见表2。

表1 PCR引物序列、退火温度以及限制性内切酶Table 1.PCR primer sequences，annealing temperature and restriction enzymes

表2 各位点酶切后不同片段长度对应基因型Table 2.Genotype of each locus and length of DNA fragment after restriction enzyme digestion

3.3 IFN－γ基因+874A/T多态性的检测 利用等位基因特异性－聚合酶链反应(allele specificpolymerase chain reaction，AS－PCR)技术检测。设计合成等位基因特异性引物［7］，上游引物T:5'－TTCTTACAACACAAAATCAAATCT －3'，上游引物 A:5'－TTCTTACAACACAAAATCAAACA －3'，通用下游引物:5'－TCAACAAAGCTGATACTCCA －3';β －action上游引物:5'－ CTACAATGAGCTGCGTGTGG －3'，下游引物:5'－AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC －3'。PCR扩增特异性片段，每1例标本分2管扩增，即2次平行的PCR过程。PCR反应条件:95℃预变性4 min，95 ℃ 15 s，62 ℃ 50 s，72 ℃ 40 s，共10 个循环，95 ℃20 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，共20 个循环，72 ℃8 min，4℃保存。PCR反应结束以1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物及基因分型。β－action作为内参照(500 bp)。如果2管均扩增出包含IFN－γ基因+874位点的目的条带(264 bp)则为AT基因型;如果含上游引物A的反应管扩增出目的条带，T管无目的条带则为AA基因型;若含上游引物T的反应管扩增出目的条带，A管无条带则为TT基因型。

3.4 IFN－γ基因CA重复序列多态性的检测 利用毛细管电泳技术检测。先PCR扩增目的片段，上游引物 5'－GCTGTCATAATAATATTCAGAC －3'，下游引物 5'－ CGAGCTTTAAAAGATAGTTCC －3'［8］，其中上游引物5'端加FAM荧光标记。PCR反应条件:95 ℃预变性4 min，95 ℃40 s，52 ℃40 s，72 ℃40 s，共35个循环，72℃ 8 min，4℃保存。取适量PCR扩增产物在ABI 3730XL仪器上进行毛细管电泳分离，并加入分子量内标进行标记。电泳图经Gene Marker V1.6软件进行DNA片段长度分析。片段长度122 bp为CA重复12次，124 bp为CA重复13次，以此类推。电泳图为1个波形则为纯合子，2个波形为杂合子，以此确定各研究对象的基因型。

3.5 外周血IFN－γ、IL－4和总IgE水平检测 采用ELISA技术测定外周血IFN－γ、IL－4和总IgE含量。按照试剂盒操作步骤进行各项指标检测。

4 统计学处理

结 果

1 各位点基因型检测结果

本研究中IFN－γ基因－179位点未检测到突变基因型，所有研究对象均为GG基因型，酶切产物电泳基因分型结果见图1。IFN－γ基因+874位点存在AA、AT和TT 3种基因型，PCR产物电泳基因分型结果见图2。IFN－γ基因第1内含子区CA重复序列经毛细管电泳技术检测显示，在广东珠三角地区人群中CA序列可重复11次至18次，即存在8个等位基因CA11－CA18，图3为CA重复序列毛细管电泳结果分析图。IL－4基因－33和－589位点均存在CC、CT和TT 3种基因型，PCR产物电泳基因分型结果分别见图4，5。病例组和对照组各位点基因型及等位基因频率分布情况见表3。经Hardy－Weinberg遗传平衡定律检验表明，对照组IFN－γ基因(+874A/T和CA重复序列)及IL－4基因(－33C/T和－589C/T)各位点基因型频率均符合Hardy－Weinberg遗传平衡(均P＞0.05)，说明资料代表性好。

Figure 1.The result of PCR－RFLP at－179 locus of IFN－γ gene.1，9:DNA marker;2，8:PCR product;3 －7:GG genotype.图1 IFN－γ基因－179位点PCR－RFLP结果

Figure 2.The result of AS－PCR at+874A/T polymorphism of IFN － γ gene.1:DNA marker;2:TT genotype;3，5:AA genotype;4:AT genotype.图2 IFN－γ基因+874A/T位点AS－PCR结果

Figure 3.The result of capillary electrophoresis at CA repeat polymorphism of IFN － γ gene.A:CA12CA12genotype，122 bp;B:CA12CA15genotype，122 bp and 128 bp.图3 IFN－γ基因CA重复序列毛细管电泳结果

表3 病例组和对照组4个多态性位点的基因型及等位基因频率分布Table 3.The genotype and allele frequencies of 4 polymorphism loci in IFN－γ and IL－4 gene among asthma patients and control subjects

2 IFN－γ基因+874位点和CA重复序列多态性与哮喘的关联分析

哮喘组与对照组IFN－γ基因+874位点AA、AT和TT基因型频率分别为65.0%与61.5%、33.0%与35.2%、2.0%与3.3%，2组差异无显著(χ2=0.522，P＞0.05)。等位基因A和T在哮喘组与对照组频率分别为81.5%与79.1%、18.5%与20.9%，2组差异无显著(χ2=0.399，P ＞0.05)。

Figure 4.The result of PCR－RFLP at－33C/T polymorphism of IL－4 gene 1，9:DNA marker;8:PCR product;2，5 －7:CT genotype;3:CC genotype;4:TT genotype.The fragment of 15 bp was not displayed because it was running fast on the native polyacrylamide gel.图4 IL－4基因－33C/T位点PCR－RFLP结果

Figure 5.The result of PCR－RFLP at－589C/T polymorphism of IL －4 gene.1，10:DNA marker;2:PCR product;3，4，8，9:TT genotype;5，7:CT genotype;6:CC genotype.The fragment of 18bp was dim because it was running fast on the native polyacrylamide gel.图5 IL－4基因－589C/T位点PCR－RFLP结果

IFN－γ基因CA重复序列CA12+CA12+、CA12+CA12－和CA12－CA12－基因型频率在哮喘组与对照组分别为1.1%与1.7%、28.7%与30.6%、70.2%与67.8%，2组无显著差异(χ2=0.239，P＞0.05)。等位基因CA12+和CA12－在哮喘组与对照组频率分别为15.4%与16.9%、84.6%与83.1%，无显著差异(χ2=0179，P ＞0.05)。

3 IL－4基因－33位点和－589位点多态性与哮喘的关联分析

IL－4基因－33位点CC、CT和TT基因型频率在哮喘组与对照组分别为1.0%与2.5%、23.0%与40.2%、76.0% 与 57.4%，2组差异显著(χ2=8.539，P＜0.05)。等位基因C和T在哮喘组与对照组频率分别为12.5%与22.5%、87.5%与77.5%，2组差异显著(χ2=7.502，P ＜0.01)，ORC/T=0.49(95%CI=0.29 －0.82)，ORT/C=2.04(95%CI=1.22－3.41)。

IL－4基因－589位点CC、CT和TT基因型频率在哮喘组与对照组分别为1.0%与3.3%、19.0%与35.2%、80.0% 与 61.5%，2组差异显著(χ2=9.161，P＜0.05)。等位基因C和T在哮喘组与对照组频率分别为10.5%与20.9%、89.5%与79.1%，2组差异显著(χ2=8.752，P ＜0.01)，ORC/T=0.44(95%CI=0.26 －0.77)，ORT/C=2.25(95%CI=1.30－3.89)。

4 各位点不同基因型外周血IFN－γ、IL－4和总IgE含量的比较

哮喘组IFN－γ浓度(ng/L)(M=17.61，P25=8.68，P75=32.64)明显低于对照组(M=43.45，P25=32.02，P75=67.41)(P＜0.01)。哮喘组IL－4浓度(ng/L)(M=26.46，P25=12.49，P75=45.35)明显高于对照组(M=11.42，P25=7.36，P75=17.21)(P＜0.01)。哮喘组总 IgE浓度(103U/L)(M=49.17，P25=16.14，P75=117.20)高于对照组(M=35.42，P25=18.55，P75=62.24)(P＜0.05)。IFN－γ基因+874位点由于TT基因型频率较少，仅对AA和AT基因型个体IFN－γ含量进行比较，见表4。AA基因型IFN－γ含量低于AT基因型(P＜0.05)。CA重复序列CA12纯合子个体较少，仅比较CA12杂合子(CA12+CA12－)和非CA12纯合子(CA12－CA12－)个体IFN－γ含量差异无显著(P＞0.05)。IL－4基因－33和－589位点均存在3种基因型，但由于CC基因型频率均较少，故仅对2个位点的CT和TT基因型个体外周血IL－4和总IgE水平进行比较，见表5。－33和－589位点TT基因型外周血IL－4和总IgE浓度均高于CT基因型，经检验仅有－33位点TT基因型个体外周血IL－4水平高于CT基因型(P＜0.05)。

表4 IFN－γ基因+874A/T位点和CA重复序列不同基因型IFN－γ水平比较Table 4.The levels of IFN－γ among different genotypes in IFN－γ gene+874A/T and CA repeat polymorphisms

表5 IL－4基因－33C/T和－589C/T位点不同基因型IL－4和总IgE水平比较Table 5.The levels of IL－4 and total IgE among different genotypes in IL－4 gene－33C/T and －589C/T polymorphisms

讨 论

哮喘是复杂的多基因性遗传病，具有明显的遗传易感性。Bream等［9］对美国人群进行研究发现，IFN－γ基因启动子区亦存在多态性位点即－179G/T，此位点突变后能与转录激活蛋白－1类似物结合，在TNF－α诱导下可上调IFN－γ基因的转录，从而IFN－γ表达增高。Cabantous等［10］对马里巴马科地区儿童脑型疟疾研究发现此位点T等位基因者IFN－γ表达水平增高，从而增强对疟疾感染的控制，降低脑型疟疾的发生。对我国北方汉族人群研究显示此多态性位点与HBV感染存在相关性［4］。但该位点T等位基因的变异率低，我国北方汉族人群为5.71%，在我国南方汉族人群中的分布情况如何?未见有报道。此外，该位点位于启动区，通过与转录因子的结合影响IFN－γ基因转录，从而影响IFN－γ的表达水平，此位点是否与哮喘存在相关性，至今国内外尚未见报道。本实验首次对广东珠三角地区哮喘儿童和对照儿童进行－179位点研究，结果显示该位点未检测到突变基因型，所有研究对象均为GG纯合子，说明IFN－γ基因－179位点可能与哮喘易感性无关联。

Hussein等［7］对埃及地区75名特应性疾病患者(特异性哮喘、特异性皮炎、变应性鼻炎)研究显示，+874 A/T多态性与特应性疾病显著相关，并且IgE水平和嗜酸粒细胞数升高及血清IFN－γ降低程度在基因型AA组同TT组相比有显著差异。国内也有学者研究显示此多态性位点可能与我国重庆地区成人哮喘的遗传易感性相关［11］。本研究结果显示:IFN－γ基因+874位点AA、AT和TT基因型频率分布在哮喘组与对照组之间无显著差异，P＞0.05。但通过对不同基因型血浆IFN－γ水平比较发现，AA基因型组IFN－γ水平明显低于基因型AT组(P＜0.05)，874位点多态性与血浆IFN－γ水平存在着相关性，是否影响哮喘疾病的严重程度，影响疾病的预后，尚需进一步研究。

CA重复序列位于IFN－γ基因第1内含子区。毛细管电泳技术检测显示，在广东珠三角地区人群CA序列可重复11次至18次，即存在8个等位基因CA11－CA18，这与台湾学者的研究结果不同，在台湾人群中CA序列可重复12次至18次［12］。此外，印度学者研究显示印度人CA序列可重复10次至18次［13］。本文对哮喘组和对照组 CA重复序列的CA12+CA12+、CA12+CA12－和CA12－CA12－3种基因型频率分布进行比较，并未发现其与哮喘易感性相关，这与Kumar等［14］的研究结果一致。但台湾学者［12］和印度学者［13］研究显示此位点与哮喘存在相关性。这可能与人种的不同、地区差异以及研究方法不一致有关。我们同时对不同基因型个体血浆IFN－γ水平进行比较，结果发现CA12+CA12－基因型IFN－γ含量与CA12－CA12－基因型无显著差异(P＞0.05)。

IL－4基因－33C/T位点位于起始密码子ATG上游－33 bp处，同时也是转录起始点下游33 bp位置，又记做 +33C/T。Gervaziev等［15］对俄罗斯人群研究显示，此位点与哮喘易感性及哮喘患者体内IL－4、血浆总IgE水平存在相关性。我国学者研究显示此位点与哮喘易感性和血清总IgE水平升高相关联［16］。这可能由于此位点的变异改变了其与CREB(c－AMP反应元件结合蛋白)结合的稳定性，进而影响了IL－4基因转录［15］，也可能是由于 －589位点与－33位点存在连锁不平衡。但是，有学者对台湾地区哮喘患者13个多态性位点进行研究，结果显示－33C/T位点与哮喘无相关性［17］。本组资料研究显示－33位点基因型和等位基因频率分布在哮喘组和对照组均有显著差异，T等位基因是哮喘易感基因，T等位基因者患哮喘的风险是C等位基因者的2.04倍。同时也发现－33位点TT基因型个体外周血IL－4浓度均高于CT基因型者，但对－33位点不同基因型的总IgE水平进行比较却未发现两者的相关性。本研究结果提示－33位点多态性与哮喘易感性存在密切关系，T等位基因增加患哮喘的风险，可能通过影响IL－4表达参与哮喘的发生、发展。

伊朗学者研究显示IL－4基因－589位点T等位基因与哮喘易感性相关［6］。俄罗斯学者研究显示此位点与哮喘患者体内IL－4水平、血清总IgE水平亦存在相关性［15］。此外，对台湾人群的研究显示该多态性位点与哮喘易感性及气道高反应性(的严重度)密切相关，但与血清总IgE水平无相关性［18］。我们的研究显示:－589位点基因型和等位基因频率分布在哮喘组和对照组均有显著差异。T等位基因是哮喘易感基因，T等位基因者患哮喘的风险是C等位基因者的2.25倍。进一步对－589位点多态性与血浆IL－4和总IgE水平的相关性进行分析，结果显示－589位点与血浆IL－4和总IgE并无相关性。哮喘是一个复杂的疾病过程，众多免疫细胞及其产生的细胞因子参与其发病，血浆IL－4和总IgE浓度可能还受到其它因素的影响。

对哮喘相关基因多态性的研究还处于初始阶段，随着分子遗传学及分子生物学技术的不断发展，对哮喘相关基因多态性进行深入的研究，将对哮喘发病机制探讨、确定哮喘易感个体和哮喘的基因治疗提供理论基础。

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