后处理对肠缺血－再灌注大鼠肺组织凋亡相关基因表达的影响*

褚薇薇， 聂 蕾， 和新盈， 闫爱丽， 周 伊， 吴庚利， 张润岐

(西安医学院基础部病理教研室，陕西 西安 710021)

肺是肠缺血－再灌注损伤最常见的受损靶器官之一［1］。常见于腹腔动脉、肠系膜上动脉、门静脉阻断后恢复血流过程引起的急性肺损伤。急性肺损伤是临床一种常见的危重病，死亡率高。因此，研究肠缺血－再灌注致急性肺损伤的发生机制和寻找相应的防治措施具有十分重要的临床意义。

缺血后处理是近年发现的一种新的外科机械性干预措施，即再灌注前给予反复短暂的再灌注/停灌注的方法［2］。目前，缺血后处理已经成为缺血－再灌注损伤研究领域中的热点，但大多集中在缺血－再灌注损伤的心肌和肝脏方面，对肠缺血－再灌注致急性肺损伤的作用及其机制的研究国内外少见报道［3］。课题组前期工作已经探讨了后处理抗大鼠肠缺血－再灌注损伤的作用及其机制［4］。本研究通过观测后处理对肠缺血－再灌注大鼠肺组织凋亡相关基因的影响，进一步深入研究其对肠缺血－再灌注致肺损伤的作用及其机制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂 第1条链合成试剂盒购自Fermentas。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。凋亡调控蛋白 B cell lymphoma/leukemia－2(Bcl－2)、Bcl－2 associated X(Bax)和 caspase－3 mAb由Santa Cruz提供。辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠Ⅱ抗、小鼠抗β－actin mAb由北京博奥森生物技术有限公司提供。

1.2 动物 健康雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠，24只，体重230－280 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，术前禁食12 h，不禁水。

2 方法

2.1 动物模型复制 腹腔注射200 g/L乌拉坦(1.0 g/kg)麻醉后，仰卧固定于操作板上，消毒后取腹正中切口长约3 cm进腹，用温盐水纱布将肠管推向左侧腹腔，暴露右肾内上方的肠系膜根部，找到肠系膜上动脉(superior mesenteric artery，SMA)，在其根部用无创伤血管夹夹闭阻断SMA血运45 min，造成肠缺血模型，然后松夹，再灌注6 h后经颈动脉放血处死。

2.2 实验动物分组及处理 动物随机分为3组(n=8):(1)假手术(sham)组:仅行开腹，分离SMA不夹闭;(2)缺血－再灌注(ischemia－reperfusion，I/R)组:方法见模型复制;(3)缺血后处理(ischemic postconditioning，IPOST)组:缺血45 min后即刻行3个循环(灌注30 s后阻断30 s)，余同I/R组。于再灌注6 h后，各组大鼠处死取材。

2.3 大鼠肺组织形态学观察 左肺下部用10%中性甲醛固定24 h后，常规石蜡包埋、切片，HE染色后光镜下观察肺组织形态结构变化。

2.4 肺组织湿/干比值检测 各组大鼠处死后，开胸取双肺，滤纸吸干肺表面水分和血迹后称重，置85℃ 烘箱内，干燥24 h至恒重，再称重，计算肺组织湿重与干重比值(lung wet/dry weight ratio，W/D)，表示肺水肿形成情况。

2.5 大鼠肺组织 Bcl－2、Bax和 caspase－3 mRNA表达的检测 采用RT－PCR方法，严格按照试剂盒说明书操作。提取肺组织总RNA，逆转录合成cDNA第1链，PCR扩增 Bcl－2、Bax和 caspase－3。Bcl－2引物上游5'－CTGGTGGACAACATCGCTCTG －3'，下游5'－ GGTCTGCTGACCTCACTTGTG － 3'，产物长度为228 bp。Bax引物上游5'－TCCAGGATCGAGCAGA－3'，下游5'－AAGTAGAAGAGGGCAACC －3'，产物长度为256 bp。Caspase－3引物上游 5'－GGAGCTGGACTGTGGCATTGA －3'，下游 5'－ CAGTTCTTTCGTGAGCATGGA－3'产物长度为232 bp。β－actin引物上游5'－ATTGTAACCAACTGGGACG －3'，下游 5'－TTGCCGATAGTGATGACCT －3'，产物长度为 533 bp。采用终体积为25 μL的反应体系，94℃ 1 min，55℃1 min，72 ℃ 1 min，扩增 35个循环，72 ℃ 10 min。10 μL的PCR产物加入凝胶加样孔中，80 V电压行电泳40 min后紫外光下观察和记录结果并照相保存。在Gel Doc(Bio－Rad)凝胶成像分析系统上扫描定量。以β－actin为内参照，根据各条带的A值分析Bcl－2、Bax mRNA表达水平。

2.6 大鼠肺组织Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白表达的检测 肺组织蛋白提取后，BCA法测定蛋白含量，按每泳道加总蛋白50 μg进行SDS－PAGE凝胶电泳，湿转至硝酸纤维素滤膜，50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，加入小鼠抗大鼠Bcl－2、Bax和caspase－3(1∶1000)Ⅰ抗，4℃孵育过夜，吐温20－磷酸盐缓冲液洗膜4次，每次15 min，加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(1∶6000)，增强化学发光系统(enhanced chemiluminescene，ECL)显色20 min，X 光片曝光。β－actin作为内参照，对上样一致性进行评估。采用GDS－8000型凝胶成像分析系统进行半定量分析。

3 统计学处理

应用SPSS 12.0统计软件包进行分析和检验，组间比较采用方差分析，当P＜0.05时，进一步作均数的两两比较用q检验。结果用均数±标准差()表示。

结 果

1 大鼠肺组织病理学变化

假手术组大鼠肺组织未见明显形态学异常，肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡内未见水肿液及血液淤滞;缺血－再灌注组大鼠可见肺泡间隔明显增宽、毛细血管扩张充血、大量炎症细胞浸润等;缺血后处理组以上病理改变均较缺血－再灌注组有不同程度缓解，见图1。

2 肺组织湿/干比值

与假手术组相比，缺血－再灌注组肺组织W/D明显增加(P＜0.05)，而缺血后处理组肺组织W/D则显著低于缺血－再灌注组(P＜0.05)，见图2。

Figure 1.Histopathological changes of rat lungs 6 h after intestine ischemia/reperfusion(I/R)injury(HE staining，×100).A:sham group;B:I/R group;C:ischemic postconditioning group.图1 大鼠肺组织病理变化

3 大鼠肺组织Bcl－2、Bax和caspase－3 mRNA表达的变化

假手术组大鼠肺组织Bcl－2、Bax和caspase－3 mRNA的表达相对较低或不表达;缺血－再灌注组大鼠肺组织Bcl－2 mRNA表达下调，Bax和caspase－3 mRNA表达明显上调(P＜0.05);而缺血后处理组Bcl－2 mRNA表达水平明显高于缺血－再灌注组(P＜0.05);Bax和caspase－3 mRNA表达量则明显低于缺血－再灌注组(P＜0.05)，见图3、4。

Figure 2.Lung W/D ratio of rats 6 h after intestine ischemia/reperfusion..n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs I/R group.I/R:intestine ischemia/reperfusion.IPOST:ischemic postconditioning.图2 各组大鼠肺组织W/D变化

Figure 3.The mRNA expression of Bcl－2，Bax and caspase－3 in lungs of rats 6 h after intestine ischemia/reperfusion.Lane 1:sham group;Lane 2:intestine I/R group;Lane 3:IPOST group;M:DNA marker(100 bp).图3 大鼠肺组织中Bcl－2、Bax和caspase－3 mRNA的表达

Figure 4.The mRNA expression of Bcl－2，Bax and caspase－3 in lungs of rats 6 h after intestine ischemia/reperfusion..n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs I/R group.图4 大鼠肺组织中Bcl－2、Bax和caspase－3 mRNA的表达

4 大鼠肺组织Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白表达的变化

假手术组大鼠肺组织Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表达相对较低或不表达;缺血－再灌注组大鼠肺组织Bcl－2蛋白表达水平下降，Bax和caspase－3蛋白表达明显增加(P＜0.05);而缺血后处理组Bcl－2蛋白表达水平明显升高(P＜0.05);Bax和caspase－3蛋白表达量则明显降低(P＜0.05)，见图5、6。

Figure 6.Comparison of the protein expression of Bcl－2，Bax and caspase－3 in lungs of rats 6 h after intestine ischemia/reperfusion..n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs I/R group.图6 大鼠肺组织中Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表达

讨 论

缺血－再灌注损伤能造成远隔器官受损，即非缺血区域组织器官功能的损伤。肠缺血－再灌注损伤不仅可以引起肠道局部的组织损害和肠道机械屏障功能受损，而且可以导致肠源性细菌和内毒素移位进入体循环造成全身扩散。肺是肠缺血－再灌注损伤最常见的受损靶器官之一［1］。本研究发现，缺血－再灌注组大鼠出现肺泡壁增宽、大量炎症细胞浸润、毛细血管扩张、血液淤滞等病理变化。

肠缺血－再灌注损伤诱发体内细胞因子和炎症介质的激活，进而启动嗜中性白细胞在肺内聚集并释放氧自由基引起细胞凋亡是导致急性肺损伤的中心环节。细胞凋亡是一种受基因调控的主动性细胞死亡，表现为凋亡信号通路的启动及相关基因的表达。其中Bcl－2家族成员是细胞凋亡过程中的一类重要抑凋亡基因;另一类是促凋亡基因如Bax等。细胞凋亡的发生很大程度上取决于促凋亡成员和抑凋亡成员的相对浓度［5－7］。Bcl－2 和 Bax分别是典型的抑凋亡和促凋亡蛋白。Bcl－2蛋白主要分布于核膜、内质网膜和线粒体膜上。Bax正常情况主要位于细胞质中，在凋亡信号诱导后很快迁移到线粒体，2个Bax蛋白相互聚合形成同二聚体，作为细胞色素C通过线粒体膜进入胞质的通道，促进细胞凋亡。由此看出，Bcl－2/Bax两蛋白之间比例是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。本实验研究结果发现，肠缺血－再灌注组大鼠肺组织Bcl－2 mRNA和蛋白表达水平下降，而Bax mRNA和蛋白表达水平则明显升高，提示大鼠肠缺血－再灌注损伤致肺组织细胞凋亡的发生与凋亡调控基因Bcl－2和Bax的表达异常有关。

Vinten－Johansen等［8］发现，缺血后处理可减少再灌注损伤特别是心肌梗死、细胞凋亡。Dosenko等［9］证明缺氧后处理不仅能减少心肌再灌注时细胞的坏死也能减少细胞凋亡。本研究采用3个循环的30s灌注后30s阻断的缺血后处理，大鼠肺组织病理形态学变化缓解，水肿程度减轻，提示后处理具有抗肠缺血－再灌注致肺损伤的作用。本实验结果还显示，缺血后处理可使Bcl－2 mRNA表达和蛋白表达水平升高，Bax mRNA和蛋白表达降低。提示后处理可通过上调Bcl－2 mRNA和蛋白的表达，下调Bax mRNA和蛋白表达，从而减轻肠缺血－再灌注致肺损伤的作用。为了进一步证明缺血后处理的这种保护作用，本研究还检测了caspase－3的表达，结果显示，缺血后处理组大鼠肺组织中caspase－3 mRNA和蛋白的表达明显低于缺血－再灌注组，表明后处理可通过抑制caspase－3的活化减少肺组织细胞凋亡。

［1］An S，Hishikawa Y，Liu J，et al.Lung injury after ischemia－reperfusion of small intestine in rats involves apoptosis of type II alveolar epithelial cells mediated by TNF－alpha and activation of Bid pathway［J］.Apoptosis，2007，12(11):1989 －2001.

［2］Kloner RA.Preconditioning，postconditioning and their application to clinical cardiology［J］.Cardiovasc Res，2006，70(2):297－307.

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［4］褚薇薇，武步强，沙焕臣，等.缺血后处理通过抑制线粒体途径减轻缺血－再灌注诱导的肠黏膜细胞凋亡［J］.中国病理生理杂志，2009，25(1):152 －155.

［5］Tsujimoto Y.Cell death regulation by the Bcl－2 protein family in the mitochondria［J］.J Cell Physiol，2003，195(2):158－167.

［6］Kuwana T，Mackey MR，Perkins G，et al.Bid，Bax and lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane［J］.Cell，2002，111(3):331－342.

［7］Saito M，Korsmeyer SJ，Schlesinger PH.BAX－dependent transport of cytochrome c reconstituted in pure liposomes［J］.Nat Cell Biol，2000，2(8):553 － 555.

［8］Vinten－Johansen J，Zhao ZQ，Zatta A.Postconditioning－ a new link in nature’s armor against myocardial ischemia － reperfusion injury［J］.Basic Res Cardiol，2005，100(4):295－310.

［9］Dosenko VE，Nagibin VS，Tumanovskaya LV，et al.Postconditioning prevents apoptotic necrotic and autophagic cardiomyocyte cell death in culture［J］.Fiziol Zh，2005，51(3):12－17.