丹芍化纤胶囊对肝纤维化大鼠肝脏Smads分子表达的影响*

杨 婷， 谢汝佳， 罗新华， 杨 勤△

(1贵阳医学院病理生理学教研室，2贵州省人民医院传染科，贵州 贵阳 550004)

肝星状细胞的激活以及大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝脏内的沉积是肝纤维化发生发展的物质基础［1，2］。目前的研究表明，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)增生与合成胶原等细胞外基质主要由细胞因子所介导。在众多的细胞因子中，转化生长因子 β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)与HSCs的活化有密切的关系，是目前公认的致纤维化最强的细胞因子之一［3］。TGF－β的生物学效应非常广泛复杂，其信号转导过程主要依赖于其下游的一族高度保守的胞内信号蛋白－Sma和Mad的基因表达产物(sma and mothers against Dpp，Smad)蛋白家族来完成［4］。采取药物干预TGF－β/Smad信号转导过程及其关键性信号分子表达的研究已成为近年来抗纤维化研究的一个热点。本研究以大鼠肝纤维化模型为研究对象，观察了丹芍化纤胶囊对大鼠肝组织中Smad2/3、Smad4和Smad7表达的影响，以探讨肝纤维化发生的机制以及丹芍化纤胶囊治疗肝纤维化可能的作用机制。

材料和方法

1 材料

1.1 动物及分组 雄性Wistar大鼠48只，清洁级，体重180－220 g，贵阳医学院实验动物中心提供。动物随机分成3组:正常对照组(normal control group)16只，CCl4肝纤维化模型组(hepatic fibrosis，HF group)16只，丹芍化纤胶囊治疗组(Dan－Shao－Hua－Xian，DSHX therapy group)16只。

1.2 药品和主要试剂 丹芍化纤胶囊(由汉防己甲素、丹参、赤芍、黄芪、银杏叶组成)，贵阳制药厂生产，棕黄色细颗粒胶囊制剂，临用前取胶囊内容物研磨成粉末，用蒸馏水稀释至所需浓度。四氯化碳(CCl4，重庆无机化学试剂厂生产)。Anti－actin(Calbiocam)，mouse anti－ Smad2/3(BD Biosciences)，mouse anti－ Smad4、goat anti－ Smad7(Santa Cruz)、rabbit anti－Smad7(武汉博士德公司)。RTPCR所需的引物由Primer Express软件(Biosystems)设计，RT－PCR所需的试剂、96孔板(Bio－Rad)、SyBR green(Applied Biosystems)及预染蛋白marker由美国卫生院癌症/环境卫生研究所刘杰博士惠赠。Trizol试剂购自 Invitrogen。Qiagen RNeasy mini kit(Qiagen)。免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司。

2 模型复制

除正常组外，其余各组用复合病因刺激制备大鼠肝纤维化模型:皮下注射40%CCl4花生油溶液3 mL/kg(首次用纯CCl40.5 mL/kg)，每周2次，共8周;同时喂予高脂低蛋白饲料(79.5%玉米粉，20%猪油，0.5%胆固醇)，间日以30%乙醇为饮料。正常组给予正常饮食。造模结束后CCl4肝纤维化组大鼠股动脉放血处死，留取血液及全部肝脏。剩余大鼠除正常组外，其余治疗组每天给予丹芍化纤胶囊灌胃1次，给药量为1 g/kg BW(相当于临床用药量的16倍)，观察8周，实验结束时股动脉放血处死全部动物(此时正常组存活16只大鼠，肝纤维化模型组还存活12只大鼠，治疗组存活10只大鼠，其余死亡)。

3 观察指标

3.1 生化测定 分别于造模结束和治疗8周后，留取尿液、血液、肝脏标本，测量以下指标:(1)肝脏指数:计算方法为(肝脏重量/体重)×100%;(2)透明质酸(hexadecenoic acid，HA)按试剂盒说明用放射免疫法测定;谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)由日立7170A全自动生化分析仪测定;(3)尿羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)排出量检测:将CCl4肝纤维化模型组、剩余各组大鼠置于代谢笼内，收集24 h尿液，严格按试剂盒说明操作。

3.2 肝脏纤维化程度 动物处死后，立即解剖，取相同部位1 cm×1 cm×0.5 cm大小肝叶浸于10%中性甲醛缓冲液中固定24 h以上，常规石蜡包埋切片行HE和van Gieson(VG)染色。光镜下观察肝脏病理变化并参照王宝恩等［1］肝纤维化分级法进行胶原纤维增生程度半定量分析。

3.3 Smad2/3、Smad4和Smad7免疫组化染色 采用免疫组化方法，Ⅰ抗为mouse anti－Smad2/3 HRP(1∶100);rabbit anti－ Smad4(1∶50);goat anti－Smad7 HRP(1∶70)，4℃过夜。次晨用磷酸缓冲盐溶液(phosphate－buffered solution，PBS)冲洗，滴加相应的Ⅱ抗，按SABC免疫组化试剂盒说明书操作，3，3'－二氨基联苯胺(3，3'－ diaminobenzidine，DAB)显色，阳性表达处为棕黄色;同时，以PBS替代Ⅰ抗作空白对照，结果为阴性。每张切片随机选取5个400倍视野，计算各组显微镜下每400倍视野的阳性细胞百分率。

3.4 Smad2/3、Smad4和Smad7实时荧光定量 PCR(qRT－PCR) 用Trizol试剂提取大鼠肝组织总RNA，随后按Qiagen RNeasy mini kit试剂盒说明书对RNA进行纯化。用紫外分光光度计测定RNA纯度和含量。将1 μg纯化RNA加入RT反应体系中(总体积 20 μL)，按 25 ℃ 10 min，48 ℃ 60 min，95 ℃5 min的反应条件反转录合成cDNA，取cDNA样品5.0 μL加入 real－time PCR反应体系(总体积25 μL)，于96孔板上加样，按照 50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。结果以normal/actin的比值进行t检验。

3.5 Smad2/3、Smad4 和 Smad7 免疫印迹(Western blotting) 每组大鼠各切取0.2 g肝脏组织加入1 mL细胞裂解液匀浆提取大鼠肝脏总蛋白，蛋白定量后每组上样150 μg，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭。Ⅰ抗以1∶100稀释，Ⅱ抗以1∶500稀释，孵育PVDF膜，用 Smad2/3和 Smad4用 DAB显色，Smad7用BCIP/NBT solution 10 mL显色，室温水平摇床振摇直至目的位置处出现清晰的条带，即用ddH2O漂洗以终止显色。用Bio－Rad凝胶成像分析系统的Quantity One软件对条带进行灰度分析，计量以平均吸光密度×面积来表示。

3 统计学处理

结 果

1 丹芍化纤胶囊对大鼠肝脏指数、血清HA、ALT的影响

与正常组比较，CCl4肝纤维化模型组大鼠肝脏指数、血清 HA、ALT、尿 Hyp均显著增加(P＜0.01或P＜0.05);丹芍化纤胶囊治疗组大鼠肝脏指数、血清HA、ALT均显著低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)，提示治疗组肝肿大有所减轻;尿Hyp排出量较模型组显著增加(P＜0.01)，说明用药后胶原降解、排出量明显增加，见表1。

表1 各组大鼠肝脏指数、血清HA、ALT的测定Table 1.The liver index，serum HA and ALT，urinary excretion of Hyp in rats()

表1 各组大鼠肝脏指数、血清HA、ALT的测定Table 1.The liver index，serum HA and ALT，urinary excretion of Hyp in rats()

△P ＜0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group;*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs HF group.Control:normal control group;HF:hepatic fibrosis model group;T:Dan－shao－hua－xian treatment group.

Control 16 0.025 ±0.003 192.52 ±41.97 32.40 ±2.30 47.80 ±5.76 HF 12 0.042 ±0.011△△316.17 ±78.48△174.50 ±6.02△△ 62.00 ±6.40△△T 10 0.027 ±0.002＊＊200.78 ±31.71*93.13 ±5.79＊＊541.09 ±73.39＊＊

2 丹芍化纤胶囊对大鼠肝脏纤维化程度的影响

经HE和VG染色，光镜下观察显示:正常组大鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，无胶原纤维增生;肝纤维化模型组大鼠肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，汇管区纤维结缔组织增生，内有较多炎性细胞浸润，同时，胶原纤维向肝实质延伸，形成纤维间隔，包绕、分割正常肝组织，形成假小叶，纤维化程度较正常组显著增加，P＜0.01;丹芍化纤胶囊治疗组大鼠肝组织结构改善明显，汇管区结缔组织增生显著减少，纤维间隔显著变薄、减少，与模型组比较差异显著。各组大鼠肝纤维化程度分级具体情况见表2。

表2 各组大鼠肝纤维化程度分级Table 2.The degree of hepatic fibrosis in rats

3 免疫组化SABC法检测丹芍化纤胶囊对大鼠Smad2/3、Smad4及Smad7表达的影响

3.1 免疫组化SABC法检测丹芍化纤对大鼠肝脏Smad2/3、Smad4表达的影响 结果显示正常组Smad2/3和Smad4的表达较少，少数肝细胞胞浆有散在分布。肝纤维化模型组Smad2/3、Smad4成圆形粗颗粒状分布于肝细胞胞浆中，也有少数分布于结缔组织中，呈棕黄色。极少数细胞核内也可见Smad2/3及Smad4的表达，见图1。Smad2/3的表达阳性率显著高于正常组(P＜0.01);丹芍化纤治疗组Smad2/3、Smad4的表达均明显减少，两者的阳性表达面积百分比均较肝纤维化组显著降低(P＜0.01)，见表3。

3.2 免疫组化SABC法检测丹芍化纤胶囊对大鼠Smad7表达的影响 结果显示正常组Smad7主要呈细颗粒状，广泛均匀地分布于肝细胞胞浆中，量多，色棕黄;肝纤维化模型组Smad7表达呈棕黄色，分布于疏松化的肝细胞胞浆中，少部分位于纤维间隔中，其表达阳性率显著少于正常组(P＜0.01)，见图1;而丹芍化纤治疗组Smad7表达染色较淡，其阳性表达面积百分比较肝纤维化组显著增高(P＜0.01)，见表3。

Figure 1.Immunohistochemistry staining showed the expression of Smad2/3，Smad4 and Smad7 in hepatic tissues(×200).图1 免疫组化染色显示肝组织中Smad2/3、Smad和Smad7的表达

表3 各组大鼠肝脏Smad2/3、Smad4、Smad7阳性表达面积百分比Table 3.The percentages of the expression of Smad7 in rat livers from various group()

表3 各组大鼠肝脏Smad2/3、Smad4、Smad7阳性表达面积百分比Table 3.The percentages of the expression of Smad7 in rat livers from various group()

△△P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs HF group.

Control16 0.82 ±0.36 1.20 ±0.48 12.80 ±2.32 HF 12 2.16 ±0.38△△ 2.45 ±0.36△△ 0.98 ±0.20△△T 10 0.81 ±0.29* 1.15 ±0.45＊＊ 3.18 ±0.72＊＊

4 Western blotting法检测丹芍化纤胶囊对大鼠肝脏 Smad2/3、Smad4、Smad7 表达的影响

4.1 Western blotting法检测丹芍化纤胶囊对大鼠Smad2/3表达的影响 以β－actin作为内参照，在56 kD附近可清楚地检测到相比邻的2组Smad2/3特异性免疫印迹条带，见图2。肝纤维化模型组Smad2/3的蛋白条带深于正常对照组;治疗组的Smad2/3的蛋白条带较肝纤维化模型组变浅，且接近正常水平。

4.2 Western blotting法检测丹芍化纤胶囊对大鼠Smad4表达的影响 以β－actin作为内参照，在66 kD附近可清楚地检测到特异性免疫印迹条带3条，见图2。与正常组比较，肝纤维化模型组Smad4的蛋白表达轻度增加;予以丹芍化纤治疗后，其表达有所下降。

4.3 Western blotting法检测丹芍化纤胶囊对大鼠Smad7表达的影响 以β－actin作为内参照，在51 kD处检测到Smad7特异性免疫印迹条带，见图2。肝纤维化模型组Smad7的蛋白条带明显浅于正常对照组，灰度分析较正常组显著降低了7倍;予以丹芍化纤治疗后，条带较模型组明显加深，灰度分析显示其表达量较肝纤维化模型组增加3倍。

5 丹芍化纤对大鼠肝组织 Smad2/3、Smad4、Smad7mRNA表达的影响

经qRT－PCR方法检测大鼠肝组织中Smad2/3、Smad4、Smad7mRNA的表达，结果发现:与正常组比较，肝纤维化模型组的Smad2/3、Smad4mRNA明显增高(P＜0.01);Smad7显著降低(P ＜0.05)。与肝纤维化模型组比较，丹芍化纤治疗组大鼠肝组织中Smad7 mRNA的表达显著增高(P＜0.05)，接近正常水平，Smad2/3、Smad4mRNA的表达轻度下降，但无显著差异，见图3。

Figure 2.Smad2/3，Smad4，Smad7 levels detected by Western blotting.A:β － actin;B:Smad2/3;C:Smad4;D:Smad7;N:normal control group;HF:hepatic fibrosis model group;T:Dan－shao－hua－xian treatment group.E:.n=8.△P＜0.05，△△P＜0.01 vs control group;*P ＜0.05 vs HF group.图2 蛋白免疫印迹法检测Smad2/3、Smad4、Smad7

Figure 3.The expression of Smad2/3，Smad4，Smad7 mRNA in rat livers from various groups..n=8.△P＜0.05，△△ P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05 vs HF group.图3 各组大鼠肝脏中Smad2/3、Smad4、Smad7 mRNA的表达量

讨 论

TGF－β/Smad信号通路在纤维化发生发展中的作用已引起医学界的广泛关注。根据结构和功能，Smads蛋白分为 3 个亚家族［2－4］:(1)受体激活型Smad(receptor activated Smad，R －Smads)，主要包括Smad2、Smad3;(2)共同通路型Smad(common mediator Smad，Co－Smad)，包括Smad4;(3)抑制型 Smad(inhibitory Smad，I－Smads)，包括 Smad6和 Smad7。

近年来，国外学者正着力于对Smads分子基因表达调控的研究［3－6］，国内学者则着力于探索药物干预对Smads分子表达的影响［7－13］。然而对TGF－β/Smad信号通路中的关键靶蛋白的研究尚处于探索阶段，许多问题尚待阐明。据此，我们观察了TGF－β的主要下游信号蛋白Smad2/3、Smad4和Smad7在肝纤维化大鼠肝脏的表达状况并探索了丹芍化纤胶囊对肝纤维化大鼠肝组织Smads的不同亚型表达的影响。

结果显示，Smad2/3与Smad4在肝纤维化大鼠肝细胞胞浆内阳性表达的形式极为相似，均从正常的弥散分布状态演变为聚集的粗颗粒状，这种形态学变化与现阶段对Smad2，3、Smad4参与纤维化需要形成聚集复合物的研究理论相一致。另外，多角度的检测揭示Smad2/3、Smad4的蛋白及mRNA的表达在肝纤维化模型组均明显增高，同时，抑制性Smad7的蛋白及mRNA的表达均显著降低。这些Smad亚型在肝纤维化肝脏中的表达变化趋势与国内一些学者的研究结果类似，提示了在大鼠肝纤维化的进程中，Smad2/3、Smad4和Smad7的转录和翻译水平均发生改变，TGF－β/Smad信号通路的活化参与了大鼠CCl4诱导性肝纤维化的发生可能是其发病机制之一。

丹芍化纤胶囊是根据中医活血化淤，通络软坚的理论及多年的临床探索研制而成的中药复方制剂，主要由丹参、赤芍、黄芪、银杏叶等组成。肝纤维化大鼠在丹芍化纤胶囊治疗8周后，肝脏指数降低，血清HA、ALT显著下降，病理组织学检查也发现肝纤维化程度明显减轻。这些结果表明:丹芍化纤胶囊可改善肝功能，减轻肝纤维化程度，对肝纤维化的治疗有一定的效果。另外，给予丹芍化纤胶囊治疗的大鼠，Smad2/3、Smad4的蛋白表达水平明显下降，但mRNA的表达与肝纤维化模型组比较几乎没有变化，而Smad7无论是蛋白的表达水平还是mRNA的表达水平均显著上调，这就提示了Smad7很可能是丹芍化纤胶囊作用的一个靶点。有研究表明，Smad7通过抑制TβRⅠ从而抑制TGF－β诱导的Smad2或Smad3磷酸化，Smad7水平在高于Smad3水平2倍时，便足以抑制TGF－β诱导的受体介导的Smad3磷酸化，由此我们推测丹芍化纤胶囊治疗后Smad2/3的表达下调很可能是因为受到Smad7的抑制。另外，治疗组的Smad2/3、Smad4的阳性表达形式从粗颗粒状又恢复为弥散分布状态，似有颗粒解聚的倾向，据此，我们推测 Smad7的上调表达还能促进Smad2/3、Smad4复合体颗粒的解聚。

综上所述，我们的研究结果表明丹芍化纤胶囊对CCl4肝纤维化有明确的治疗作用，其改善肝纤维化的作用机制与干预TGF－β/Smad信号通路有关，且可能更多是通过影响Smad7分子的转录与翻译上调抑制性 Smad7的表达，从而加强对 Smad2/3、Smad4致纤维化信号转导的反馈抑制来实现的。Smad7很可能是丹芍化纤的一个药物作用靶点，有望成为抗肝纤维化药物作用的一个靶标及疗效评价指标。我们相信以Smad7作为抗纤维化的药物作用靶点，深入探讨Smad7的基因调控机制，可能为肝纤维化的防治提供一个新的颇有希望的干预途径。

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