pNTAP－PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达*

王达安， 龚小卫， 刘爱华， 梅柱中， 王 丹， 明小燕， 王 旭，魏 洁， 邓 鹏， 姜 勇△

(1南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室，3南方医院呼吸科，广东 广州 510515;2暨南大学医学院病理生理学系，广东 广州 510632)

p38调节活化蛋白激酶(p38 regulated/activated protein kinase，PRAK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，人PRAK由471个氨基酸组成，分子量约54 kD，存在于人的多种组织及细胞中。早期有关PRAK功能的研究主要集中在介导p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase，p38MAPK)通路的细胞应激反应过程［1，2］，近年发现PRAK可能还参与调节细胞增殖和细胞衰老过程［3，4］，并在细胞周期的有丝分裂调控中发挥重要作用［5］。然而，PRAK在介导各种生理和病理过程中的确切功能及其调控的分子机制仍未完全清楚;为此，我们构建了PRAK与串联亲和纯化(tandem affinity purification，TAP)标签融合表达的载体，并建立其在HEK293细胞中稳定表达的细胞系，为利用TAP系统进一步研究PRAK在细胞信号转导过程的作用奠定基础。

材料和方法

1 主要仪器

台式微量离心机和台式低温高速离心机(Beckman);PCR仪(Biometra);Mini VE垂直电泳系统、水平电泳仪和半干电转仪(Amersham Pharmacia Biotech);凝胶成像系统(Vilber Lourmat);CO2培养箱(Heraeus);荧光显微镜(Leica);IS2000R多功能影像系统(Kodak)。

2 主要试剂

DNA ladder、质粒小量制备试剂盒和凝胶回收试剂盒(Axygen);限制性内切酶BamHⅠ/HindⅢ、高保真DNA聚合酶Pyrobest和T4 DNA连接酶(TaKa-Ra);脂质体转染试剂PolyFect 2000(Qiagen);无血清培养基Opti－MEM(Gibco－BRL);DMEM培养基和胎牛血清(HyClone);G418(Sigma);兔抗钙调蛋白结合多肽(calmodulin binding peptide，CBP)单克隆抗体(Millipore);辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG(Cell Signaling Technology);Alexa Fluor 488偶联的抗兔IgG(Molecular Probes);其它试剂均为国产分析纯;引物合成由Invitrogen公司完成。

3 质粒、菌株和细胞株

串联亲和纯化载体 pNTAP(stratagene);质粒pcDNA3.1－HA－PRAK、大肠杆菌菌株 DH5α和HEK293细胞系为本实验室保存。

4 pNTAP－PRAK重组质粒的构建及鉴定

根据GenBank中的人PRAK编码序列(序列号AF032437)设计PCR引物，其中在上游引物5'端引入BamHⅠ酶切位点，下游引物5'端引入HindⅢ酶切位点。上游引物5'－TAGGATCCTCGGAGGAGAGCGACATGGAC －3'，下游引物 5'－TCAAAGCTTTTATTGGGATTCGTGGGACGTG－3'。以 pcDNA3.1－HAPRAK质粒为模板，用高保真度DNA聚合酶Pyrobest进行PCR扩增带酶切位点的目的片段PRAK，扩增片段的大小为1.4 kb。PCR反应参数为:94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1min，共35个循环。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切，随后用T4 DNA连接酶将其与BamHⅠ/HindⅢ双酶切并电泳切胶回收的pNTAP进行16℃过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，接种至含卡那霉素(Kan+)的LB琼脂糖培养板上培养，挑取单菌落接种于LB培养基(Kan+)中，37℃振摇过夜。取菌液用质粒小量提取试剂盒提取重组质粒，分别进行PCR及BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定，并最终经DNA序列分析进行验证。构建的重组质粒命名为pNTAP－PRAK。

5 基因转染及稳定表达细胞系的筛选

将HEK293细胞接种至60 mm培养皿中，用含5%FBS的DMEM，于5%CO2、37℃孵箱中培养至约70%融合度时，采用PolyFect使用说明书介绍的方法将pNTAP－PRAK质粒转染至HEK293细胞，转染48 h后，以4000 mg/L G418筛选30 d，获得具有G418抗性的阳性细胞克隆，再用有限稀释法作单细胞化克隆筛选，扩增培养后经Western blotting及细胞免疫荧光鉴定为阳性的细胞克隆即为稳定表达TAP tagged－PRAK的 HEK293细胞系，命名为HEK293－TAP tag－PRAK细胞;以未转染的HEK293细胞作筛选的空白对照。

6 Western blotting免疫印迹分析法

收集G418筛选后的HEK293－TAP tag－PRAK细胞，裂解后取20 μL处理后的蛋白样品进行SDSPAGE电泳(5%浓缩胶，恒压80 V 30 min;12%分离胶，恒压120 V 2 h)，电转移至 PVDF膜上(恒流80 mA 1 h)，5%脱脂奶粉室温振荡封闭 3 h，与1∶8000稀释后的Ⅰ抗(兔抗CBP抗体)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，然后与1∶6000稀释后的Ⅱ抗(HRP标记的抗兔IgG)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，化学发光法检测目的蛋白表达情况。以野生型HEK293细胞裂解样品作阴性对照，瞬时转染pNTAP－PRAK质粒的HEK293细胞裂解样品为阳性对照。

7 细胞免疫荧光标记法

将HEK293－TAP tag－PRAK细胞接种至Petri皿，用含5%FBS的DMEM，于5%CO2、37℃孵箱中培养24 h，去除培养液，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗1次，用含0.1%Triton X－100的PBS(PBST)透化细胞膜5 min，PBS洗3次，0.1%硼氢化钠处理细胞5 min，PBST洗1次，3%BSA封闭2 h，PBST洗1次，加入按1∶800稀释的Ⅰ抗(兔抗CBP抗体)，4℃孵育过夜，PBST洗3次，加入按1∶500稀释的Ⅱ抗(Alexa Fluor 488偶联的抗兔IgG)，室温孵育2 h，PBST洗3次，DAPI染核5 min后封片，用Leica荧光显微镜的L5和A4滤光片观察上述重组载体在细胞中的表达和定位情况，并进行图像采集;以野生型HEK293细胞作阴性对照。

结 果

1 PRAK片段的扩增

将利用pcDNA3.1－HA－PRAK作模板进行PCR扩增得到的PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳，可见在约1.4 kb处有1条带，见图1，与预计的目的片段大小位置相符。

Figure 1.PRAK amplified by PCR.Lane 1:DNA marker;Lane 2:PCR product.图1 PRAK的PCR扩增

2 重组质粒的鉴定

pNTAP－PRAK重组质粒PCR产物及BamHⅠ/HindⅢ双酶切产物行1%琼脂糖凝胶电泳，可见约1.4 kb和4.5 kb大小的片段，与预计大小相符，见图2。DNA测序结果显示与人的PRAK开放阅读框序列一致。

Figure 2.Identification of recombinant plasmid pNTAP－PRAK.Lane 1:DNA marker;Lane 2:PCR product;Lane 3:product digested by restriction endonuclease.图2 重组质粒pNTAP－PRAK的鉴定

3 Western blotting结果

检测结果显示瞬时转染pNTAP－PRAK质粒的HEK293细胞样品和HEK293－TAP tag－PRAK细胞系样品对应泳道均可见在约62 kD(PRAK+TAP tag)处有明显的免疫杂交条带，但HEK293－TAP tag－PRAK细胞系的条带明显弱于瞬时转染pNTAPPRAK质粒的 HEK293细胞，见图 3;而野生型HEK293细胞样品对应泳道未见阳性条带。

Figure 3.Expression of fusion protein TAP tagged－PRAK in cells detected by Western blotting.Lane 1:HEK293 cells(wild type);Lane 2:HEK293 cells transientlytransfected with plasmid pNTAP－PRAK;Lane 3:HEK293－TAP tag－PRAK cell line.图3 Western blotting检测TAP tagged－PRAK的表达

4 细胞免疫荧光检测结果

HEK293－TAP tag－PRAK细胞的免疫荧光检测结果显示TAP tag－PRAK融合蛋白在所有细胞中均有表达，且融合蛋白主要分布在细胞核中;而野生型HEK293细胞内未检测到标记的蛋白绿色荧光信号，见图4。

Figure 4.Expression and localization of fusion protein TAP tagged－PRAK in HEK293－TAP tag－PRAK cell line(immunofluorescence assay，×400).1:fusion protein TAP tagged－PRAK labelled with Alexa Fluor 488;2:nucleus stained with DAPI dye.图4 TAP tagged－PRAK融合蛋白在HEK293－TAP tag－PRAK细胞系中的表达和定位

讨 论

PRAK又称MAPK激活的蛋白激酶5(MAPK－activated protein kinase 5，MAPKAPK5/MK5)，是1998年作为p38MAPK的下游底物被克隆和鉴定出来的，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶;人PRAK由471个氨基酸组成，分子量约54 kD;PRAK在人的心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾和胰腺等多种组织以及 HEK293、A549、HeLa、HepG2 和 Jurkat等细胞中均有表达［2］。在静息状态下，内源性PRAK主要分布于细胞质，而外源性PRAK则主要分布于细胞核内。实验显示，PRAK存在核－质穿梭功能;在受刺激时，PRAK入核减少，而出核增多，因而更多的PRAK分布在细胞质中［6］。PRAK是MAPK激活的蛋白激酶家族中相对较新的1个成员，相关研究报道不多;其激活途径、激活方式、下游底物、介导的功能以及核－质移位与功能之间的关系等至今尚未完全清楚。

现有的PRAK激活途径和功能研究报道主要集中在与p38MAPK和细胞外信号调节激酶(extracellular－signal regulated protein kinase，ERK)成员ERK3/4之间的相互关系方面。早期的研究报道显示 PRAK 可受 p38MAPK 通路调控;研究发现［2，4］，细胞在应激和致炎细胞因子的刺激下，PRAK的Thr182能够被p38MAPKα和p38MAPKβ磷酸化而激活，继而磷酸化并激活热休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)，从而介导细胞骨架重构，参与细胞应激反应;而且p38MAPKα和p38MAPKβ引起的PRAK磷酸化还可导致PRAK的核－质移位［5］，但PRAK的移位与其介导的功能有何关系至今未见相关报道。有研究者认为癌基因ras的表达产物Ras能通过p38MAPK通路激活PRAK，而PRAK反过来负反馈地抑制Ras介导的细胞增殖［3］。另外，最近也有研究显示，PRAK可能参与癌基因产物Ras诱导的细胞衰老过程，此过程也可能涉及p38MAPK通路;即Ras通过某种方式激活p38MAPK通路，后者引起PRAK的磷酸化、激活，激活的PRAK再磷酸化、激活p53，从而促进细胞衰老，此过程还与抑制细胞恶变有关［4］。但 Shi等［7］对 PRAK 受 p38MAPK 通路调控的观点提供了质疑，他们的研究结果显示，虽然过表达的p38MAPK能磷酸化PRAK，但生理表达水平的p38MAPK并不能显著增加PRAK活性，而且生理表达水平的PRAK也不能有效地激活HSP27。因此，PRAK与p38MAPK通路的关系还需进一步验证。另一研究较多的PRAK调控因素是ERK3/4;有研究显示［8，9］，MAKP 通路中的非典型成员 ERK3和ERK4可直接磷酸化、激活PRAK，并引起PRAK核－质移位，推测PRAK可能参与ERK3和ERK4介导的胚胎发育的调控过程;但PRAK激活后通过何种底物发挥此作用至今尚不清楚。除了p38MAPK和ERK3/4可能参与PRAK的调控外，本实验室最近的研究提示PRAK和双泛素(diubiquitin)的相互作用也可能在细胞周期的有丝分裂调控中发挥重要作用;研究结果表明，PRAK可拮抗diubiquitin介导的细胞染色体不稳定和多形核的出现;但该研究未能得到PRAK和diubiquitin在细胞内结合的直接证据［5］;而且，是什么因素调节、介导它们的相互作用也有待进一步研究阐明。综上所述，PRAK可能参与多种细胞功能的调控过程，但目前对PRAK的功能及其作用机制认识还非常有限，已有的研究结果也存在一些需要进一步验证的地方;此外，PRAK是否还有其它未发现的激活调控途径以及其它功能?这些问题都需要进一步探讨。

TAP技术是1999年由Rigaut等［10］建立起来的一种用于研究蛋白质相互作用的新方法。TAP技术的核心是:应用分子克隆方法将所研究的蛋白质复合体中一已知蛋白质组分(诱饵蛋白)克隆到带有2个不同的亲和纯化标签的表达载体上，我们构建的TAP融合载体带有链亲和素结合多肽(streptavidin binding peptide，SBP)和钙调蛋白结合多肽(calmodulin binding peptide，CBP)2种亲和纯化标签，在亲和纯化标签与诱饵蛋白构成的融合蛋白表达后，经过连续二步的亲和纯化，在生理条件下将诱饵蛋白及其相互作用的蛋白质以蛋白质复合体的形式纯化出来，再利用生物质谱等下游技术对蛋白质复合体的组分进行鉴定，从而阐明蛋白质相互作用的分子机制。该蛋白质复合体纯化策略既能保证目的蛋白的高效回收，又能保证目的蛋白的纯度，TAP的应用使蛋白质相互作用的研究在方法学上获得了重大进步。为进一步从蛋白质相互作用的角度探讨PRAK的生物学功能，我们把PRAK克隆到N端的TAP载体上，并观察其在 HEK293细胞中的表达情况。Western blotting结果显示瞬时转染pNTAP－PRAK质粒的HEK293细胞样品和HEK293－TAP tag－PRAK细胞系样品均可见分子量与PRAK+TAP tag大小相符的免疫杂交条带，说明该重组质粒能在HEK293细胞中有效表达，且PRAK与TAP tag的融合并没有影响两者的表达，也没有影响TAP tag中CBP的抗原性。此外，为减少因瞬时转染时外源性基因高表达所引起的蛋白质非特异性相互作用对将来TAP鉴定结果的影响，我们利用融合载体上的新霉素抗性，对转染pNTAP－PRAK重组质粒后的HEK293细胞进行了G418筛选，建立起稳定表达的细胞系;Western blotting鉴定结果显示HEK293－TAP tag－PRAK细胞系的条带明显弱于瞬时转染pNTAP－PRAK质粒的HEK293细胞，表明HEK293－TAP tag－PRAK细胞系能低水平稳定表达TAP tagged－PRAK，有效避免了外源性基因的过高表达。细胞免疫荧光结果显示融合蛋白主要分布在细胞核内，这与既往有关外源性PRAK的细胞定位研究结果一致［6］，说明 PRAK与 TAP tag的融合并没有影响到外源性PRAK的细胞定位。以上工作为利用TAP系统进一步深入研究PRAK的生物学功能奠定了基础。

［1］姜 勇，罗深秋.细胞信号转导的分子基础与功能调控［M］.第1版.北京:科学出版社，2005.141.

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