运用蛋白指纹图谱技术筛选类风湿关节炎患者血清特异性标志物*

张晓雪， 袁兆林， 朱 敏， 刘池波， 沈 波△， 徐 巍， 梁 勇， 王海宝

(1温州医学院附属台州医院，浙江 台州 317000;2浙江省台州市立医院，浙江 台州 318000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种多系统性炎症性的自身免疫性疾病，以慢性、进行性及对称性的多关节病变为主要特征。目前用于RA检测的实验室诊断指标存在敏感性、特异性上的局限，并不能达到早期诊断、早期治疗的目的［1］。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种蛋白质组学研究技术，现已广泛应用于生物大分子研究，是蛋白质组学研究中不可或缺的分析工具［2］。它在一定条件下，能够将样品分子电离成离子，然后测定这些离子的质荷比(mass-to-charge，m/z)和强度，并绘制出蛋白指纹图谱，进一步对其进行定性和定量分析。本研究应用蛋白质指纹图谱技术检测、分析已确诊的RA患者、骨性关节炎(osteoarthritis，OA)患者和健康体检者的血清样本，筛选出与RA疾病相关的特异性蛋白标志物，建立RA诊断模型，提高RA的早期确诊率。

材料和方法

1 材料

1.1 研究对象及分组 (1)RA组:60例(男26例，女34例)，年龄33-80岁，平均年龄(56.5±10.7)岁，诊断均符合美国风湿病学会1987年修订的RA诊断标准。(2)OA组:35例(男15例，女20例)，年龄43-79岁，平均年龄(57.0±14.3)岁。(3)健康对照组:36名(男16名，女20名)，年龄42-70岁，平均年龄(57.7±7.5)岁，肝肾功能均正常，且无自身免疫性疾病史及重大疾病史。所有的研究样本均来自2008年1月至2009年8月我院的门诊/住院患者及健康体检者。此项研究获得了温州医学院附属台州医院伦理委员会的批准，并得到了病人和健康体检者的知情同意。实验对象的临床及实验室检查基本情况见表1。

表1 实验对象的临床资料及分组信息Table 1.Clinical characteristics of the study subjects*

1.2 主要试剂及仪器 弱阳离子(weak cationic exchange，WCX)纳米磁性微球购自北京赛尔迪生物技术有限公司。乙腈(acetonitrile，ACN)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、尿素、4-(2-羟乙基)哌嗪-4'-2-乙烷磺酸［4-(2-hydroxyethyl)piperazine-4'-2-ethanesulfonic acid，HEPES］、高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)级别的水、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液［Tris(hydroxymethyl)aminoethane-HCl，Tris-HCl］、3-［3-(胆酰氨丙基)二甲铵基］丙磺酸内盐{3-［(3-cholamidopropyl)dimethylammonio］-1-propanesulfonate，CHAPS}、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、醋酸钠(sodium acetate，NaAc)以及芥子酸(sinapinic acid，SPA)等试剂均购自Sigma。PBSⅡ-C型蛋白质芯片阅读仪购自Ciphergen Biosystems。

2 方法

2.1 标本采集与处理 采集空腹静脉血5 mL于无抗凝剂的真空采血管中，立即放入4℃冰箱，静置1 h，然后在4℃下4000×g离心10 min，将分离得到的血清以每份10 μL分装，冻存于-80℃备用。

2.2 样品检测操作流程

①血清的预处理 将血清从-80℃冰箱内取出，冰浴中解冻后，4℃下20000×g离心10 min，以去除残留的细胞碎片。取5 μL血清，加10 μL U9裂解液(9 mol/L 尿 素，20 g/L CHAPS，10g/L DTT，50 mmol/L Tris-HCl，pH9.0)，充分混合后，室温下孵育30 min，使血清蛋白变性。然后加入185 μL NaAc(100 mmol/L，pH4.0)，立即混匀。

②WCX纳米磁性微球的活化 每个0.5 mL管中加入50 g/L WCX纳米磁性微球50 μL，置于磁性分离板上分离 1 min，弃上清液，加入 100 μL NaAc，活化5 min，置于磁性分离板上分离1 min，弃上清液，反复2次。

③活化的WCX纳米磁性微球捕获血清蛋白 每份弃上清液活化的磁性微球中加入100 μL处理好的血清样品，置于室温孵育30 min。然后置于磁性分离板上分离1 min，弃上清液，再加入100 μL NaAc，洗脱5 min，置于磁性分离板上分离1 min，弃上清液，反复2次。

④洗脱WCX纳米磁性微球上的血清蛋白 用5%(V/V)的TFA 10 μL将结合在磁性微球上的蛋白洗脱5 min，然后置于磁性分离板上分离1 min。取5 μL蛋白洗脱液加入5 μL饱和 SPA(50%ACN 和0.5%TFA)，充分混匀。吸取2 μL蛋白结晶混合物点样于已清洗过的金芯片(此芯片仅作为载体使用，Au-chip，Ciphergen)上，自然晾干后，待上机检测。⑤数据采集 采用PBSⅡ-C型蛋白质芯片阅读仪检测蛋白指纹图谱。每次检测前用塞弗吉公司提供的All-in-one标准多肽进行校正，系统质量偏差为0.1%。其参数设置如下，最高检测分子质量为50 kD，优化范围为2-20 kD，激光强度为180，检测敏感度为7。

3 生物信息学分析

将血清样本分成建模组和试验组进行数据分析。为了筛选出RA相关的特异性蛋白标志物及在此基础上建立RA的诊断模型，建模组随机选入30例RA患者、20例OA患者和21名健康体检者。为了评价诊断模型的敏感性及特异性，试验组随机选入30例RA患者、15例OA患者和15名健康体检者，见表1。

4 统计学处理

采用Ciphergen ProteinChip和BioMarker Wizard软件对芯片检测得到的蛋白指纹图谱进行统计学处理。RA患者与OA患者和健康体检者间的蛋白峰的比较采用t检验，将差异峰值的强度输入Biomarker Pattern软件，筛选出最具代表性的蛋白标志物，并构建出RA诊断模型。

结 果

1 用蛋白指纹图谱技术分析血清蛋白质组具有良好的可重复性

我们用WCX纳米磁性微球处理后的同一健康者血清，点样在金芯片的8个点上做重复性检测，分析了血清中的多肽及低分子量蛋白质组。被定义分析的主要蛋白峰强度的变异系数(coefficient of variance，CV)均在10%以内，说明用这种方法来分析蛋白质组具有良好的重复性，见图1。

Figure 1.Protein spectra of serum samples from one healthy control.图1 同一健康者血清的蛋白指纹图谱

2 血清标本蛋白质指纹图谱检测

归一化后的蛋白质指纹图谱分析(图2)表明，每例标本在m/z为2-20 kD范围内均能检测出约105个蛋白峰，其中处于m/z为2-10 kD的约89个，m/z为10-20 kD约16个。

3 RA组和对照组之间的血清蛋白质指纹图谱分析

用MALDI-TOF-MS技术结合WCX纳米磁性微球，对建模组的30例RA患者和41名对照者(20例OA患者和21名健康者)的血清样本进行蛋白指纹图谱分析，通过Ciphergen ProteinChip和BioMarker Wizard软件对所测得的蛋白指纹图谱进行标准化，并在m/z为2-20 kD内发现了33个具有显著差异的蛋白峰(P＜0.05)，见表2。在这些差异蛋白质中，与对照组相比，RA组有13个高表达，20个低表达。

Figure 2.Protein spectra of normalization.图2 归一化后血清蛋白指纹图谱

表2 RA组和对照组间的33个差异蛋白峰Table 1.Thirty-three discriminating m/z peaks were found with differential expression levels in the sera of RA patients and controls

4 RA患者血清蛋白标志物的筛选及诊断模型的建立

将统计分析得到的33个差异蛋白峰导入Biomarker Patterns软件，筛选诊断RA的最佳标志物。结果显示 m/z为 15715.5D、7771.4D、8959.4D、8469.8D和8710.8 D的5个蛋白质为诊断RA的最佳标志物，见图3。这5个蛋白标志物组成的诊断模型能很好地将RA患者区分出来，其诊断模型如图4。经统计分析，该模型在建模组中对RA的诊断敏感性为93.3%，特异性为95.1%。用试验组对此模型进行双盲验证后得到，其对RA诊断的敏感性为86.7%，特异性为90%，见表3。

表3 RA诊断模型的诊断特征及盲法验证结果Table 3.The characteristics of the diagnostic model and the results of blind test for RA

讨 论

RA是一种致残性很高的疾病。由于其病因和发病机制尚未阐明，早期临床表现不典型，而且缺乏较好的诊断指标，给疾病早期诊断和治疗带来了一定的困难。大量临床观察发现，RA患者关节病变在发病后第一年发展最快，发病2年后即可出现不可逆的骨关节损害［3］。所以，早期诊断和规范治疗是防止关节畸形和致残的关键。然而，目前尚没有一种检测指标同时兼具高敏感性和特异性。因此，探索和建立一种简单、快速、敏感性高和特异性强的RA早期诊断技术已成为当前亟待解决的问题。

近些年，蛋白质组学的研究得到了前所未有的发展，出现了许多蛋白质组学研究方法，其中，迅速发展的生物质谱为此提供了关键性技术手段［4］。目前，表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surfaceassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)在探寻多种疾病特异性蛋白标志物的研究中得到了广泛认可，它可以将检测物点样于相应芯片上去捕获目的蛋白，

Figure 3.Representative mapping of sera from healthy controls(C)，patients with OA，patients with RA.The x-axis represents m/z，and the y-axis represents the relative intensity.图3 建立RA诊断模型的5个蛋白峰在RA、OA患者和健康体检者(C)之间的图谱

Figure 4.Diagram of a diagnostic model for 30 patients with RA，20 patients with OA and 21 healthy controls.The intensities of the selected peaks were submitted to Biomarker Pattern software as a‘root note’.Based on peak intensity，a threshold was determined by Biomarker Pattern software to classify the root node into two child nodes.If the peak intensity of a blind sample was lower than or equal to the threshold，this peak would be labeled as“left-side child node”.Peak intensity higher than the threshold would be marked as“right-side child node”.After rounds of decision making，the training set was found to be discriminatory with the least error.图4 RA的诊断模型图

然后上机直接读取［5］。而 MALDI-TOF-MS则是借助磁珠的特性来获取样品目的蛋白，然后将蛋白结晶点样于只起载体作用的芯片上，再上机读取。与传统的蛋白芯片相比，WCX纳米磁性微球具有强大的表面积，它能够更好地捕获血清中的小分子多肽或蛋白，所以结合了WCX纳米磁性微球的MALDI-TOF-MS技术可检测到血清中更多低丰度蛋白质［6］。作为蛋白质组学研究中的经典技术，MALDI-TOF-MS具有样品用量少、操作简便、分辨力高、重复性好和敏感性高等优点［7］。它利用激光脉冲辐射使芯片上的分析物解离成气化离子，根据不同质荷比及含量的多寡，这些离子在仪器电场中飞行的时间长短不一，可直观地用位置、强弱不同的峰表现出来，由此绘制出1张质谱图用于后期分析［8］。MALDI-TOF-MS 技术在肿瘤［9，10］、心肌梗死［11］、以及自身免疫性疾病［12-14］等研究中均有涉足，为疾病的早期诊断提供了重要帮助。

本研究通过WCX纳米磁性微球结合MALDITOF-MS技术，对60例RA患者、35例OA患者及36名健康体检者进行血清蛋白质谱分析。Ciphergen ProteinChip和BioMarker Wizard软件初步筛检结果显示，与对照组(OA患者和健康体检者)相比，RA组共存在33个差异蛋白。其中，13个蛋白质在RA组中高表达，20个低表达。这些均提示通过本实验的蛋白质检测技术，可以在RA患者中找到一些区别于OA患者和健康体检者的蛋白质。而且从差异蛋白质的数量上和表达程度上来看，参与RA发病机制的免疫反应蛋白较多，免疫介导反应过程复杂，这也可能是至今还未能阐明RA发病机制的原因之一。对33个差异蛋白进一步经Biomarker Patterns软件分析，得到5个最佳潜在血清蛋白标志物，它们的m/z分别为 15715.5D、7771.4D、8959.4D、8469.8D 和8710.8 D。这5个标志物构建的诊断模型可以分别将RA患者与OA患者和健康体检者很好的区分开。60例标本盲法验证结果显示其敏感性为86.7%，特异性为90.0%。这说明在RA发病过程中这5种蛋白质发生了特征性变化，它们之间的联合和/或相互的变化可能与RA的发生发展密切相关，对提高RA的确诊率具有重要的意义。而且该模型对RA诊断的敏感性、特异性均较高，弥补了传统自身抗体不能兼顾“双高”的缺点。

MALDI-TOF-MS结合WCX纳米磁性微球技术将会对RA的早期诊断、早期治疗等方面具有一定的价值。它可以快速、有效地检测到与RA相关的特异性蛋白标志物，并构建出敏感性、特异性均较高的诊断模型，为临床上RA诊断提供了良好的前景。

［1］Hoffman IE，Peene I，Pottel H，et al.Diagnostic performance and predictive value of rheumatoid factor，anti-citrullinated peptide antibodies，and the HLA shared epitope for diagnosis of rheumatoid arthritis［J］.Clin Chem，2005，51(1):261-263.

［2］Posadas EM，Simpkins F，Liotta LA，et al.Proteomic analysis for the early detection and rational treatment of cancer-realistic hope?［J］.Ann Oncol，2005，16(1):16-22.

［3］van Vollenhoven RF.Treatment of rheumatoid arthritis:state of the art 2009［J］.Nat Rev Rheumatol，2009，5(10):531-541.

［4］沈 静，杨 军，余应年.质谱技术在蛋白质组学中的应用［J］.中国病理生理杂志，2005，21(10):2057-2061.

［5］何文娟，胡 豫，张小平，等.SELDI-TOF-MS技术检测心绞痛患者血浆蛋白指纹图谱的研究［J］.中国病理生理杂志，2009，25(2):389-391.

［6］Li YZ，Hu CJ，Leng XM，et al.Promising diagnostic biomarkers for primary biliary cirrhosis identified with magnetic beads and MALDI-TOF-MS［J］.Anat Rec(Hoboken)，2009，292(3):455-460.

［7］Sparbier K，Wenzel T，Dihazi H，et al.Immuno-MALDI-TOF MS:new perspectives for clinical applications of mass spectrometry［J］.Proteomics，2009，9(6):1442-1450.

［8］Zhou M，Veenstra T.Mass spectrometry:m/z 1983-2008［J］.Biotechniques，2008，44(5):667-670.

［9］Wang P，Whiteaker JR，Paulovich AG.The evolving role of mass spectrometry in cancer biomarker discovery［J］.Cancer Biol Ther，2009，8(12):1083-1094.

［10］吴晓滨，彭俊生，李初俊，等.蛋白质组学检测结直肠腺瘤及早期恶变患者血清的差异蛋白质变化及意义［J］.中国病理生理杂志，2009，24(6):1098-1103.

［11］Marshall J，Kupchak P，Zhu W，et al.Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction［J］.J Proteome Res，2003，2(4):361-372.

［12］Komurasaki R，Imaoka S，Tada N，et al.LKM-1 sera from autoimmune hepatitis patients that recognize ERp57，carboxylesterase 1 and CYP2D6［J］.Drug Metab Pharmacokinet，2010，25(1):84-92.

［13］Huang Z，Shi Y，Cai B，et al.MALDI-TOF-MS combined with magnetic beads for detecting serum protein biomarkers and establishment of boosting decision tree model for diagnosis of systemic lupus erythematosus［J］.Rheumatology(Oxford)，2009，48(6):626-631.

［14］Giusti L，Baldini C，Bazzichi L，et al.Proteomic diagnosis of Sjögren's syndrome［J］.Expert Rev Proteomics，2007，4(6):757-767.