类风湿关节炎CD4+CD28－T细胞与淋巴细胞凋亡的相关性研究*

陈瑞林， 陶 怡， 黄文辉

(广州医学院第二附属医院风湿免疫科，广东 广州 510260)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的以关节滑膜炎为特征的全身性自身免疫性疾病，呈慢性侵蚀性的炎症过程［1］。RA的发病机制复杂，至今仍未完全阐明，其中T细胞介导的自身免疫反应及凋亡异常被认为是RA发病的重要机制。本研究通过检测汉族人群RA患者外周血CD4+T细胞亚群情况，明确RA患者是否存在异常T细胞亚群的扩增及其与外周血淋巴细胞凋亡的相关性，以探讨T淋巴细胞亚群异常增殖在RA发病机制中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂和仪器 Ficoll淋巴细胞分离液;PE－Cy5标记的CD3单抗，PE标记的CD4单抗及其同型对照;FITC标记的CD28单抗及其同型对照(Beckman Coulter);磷脂酰丝氨酸结合蛋白(Annexin V)－FITC;碘化丙啶(PI)(深圳晶美生物公司);流式细胞仪(Beckman Coulter)。

1.2 病人资料 2005年12月－2007年12月在本院风湿免疫科就诊的RA患者50例，其中37例女性和13例男性，平均年龄(50.12±13.8)岁(24－82岁)，均符合美国风湿病学会(ACR)1982年修订的诊断标准。所有RA患者均为新近诊断或在进入研究前1个月无服用缓解病情抗风湿药(DMARD)药物或激素;如患者服用非甾体抗炎药(NSAID)，在进入研究前1个月剂量已稳定。健康对照组50名，(女性30名，男性20名)，平均年龄(45.25±14.24)岁(22－65岁)，经问诊和体检排除自身免疫性疾病史。2组间年龄无显著差异。

2 方法

2.1 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)的制备 抽取清晨空腹静脉血20 mL，肝素抗凝，在收集标本后1 h内进行淋巴细胞的分离、培养;采用Ficoll Hypaque密度梯度离心法，在淋巴细胞分离液和血浆层间收集淋巴细胞后，用PBS洗涤，一部分直接检测细胞表型及凋亡，一部分在RPMI－1640完全培养基培养24 h。

2.2 细胞培养 23例RA患者和24例健康对照者的淋巴细胞分为对照组和实验组，2组均加入培养液:含10%小牛血清、2 mmol/L谷氨酸和1×105U/L青霉素－链霉素的RPMI－1640完全培养基;实验组再加入植物血凝素(phyto－hemagglutinin，PHA)(终浓度为10 mg/L)刺激淋巴细胞以诱导淋巴细胞增殖活化;均在5%CO2、37℃细胞培养箱中培养24 h。培养24 h后收集悬浮细胞。

2.3 细胞表型检测 新鲜分离的淋巴细胞用PBS重悬，调整细胞浓度为1×106cells/L，吸取100 μL细胞悬液，加入FACS测定管，待测淋巴细胞悬液加入荧光标记的抗体CD3－PE－Cy5、CD4－PE、CD28－FITC各10 μL组合标记，并设立同型对照，混匀后室温避光孵育20 min，取出后每管加入PBS 1 mL，混匀后水平离心机1000 r/min离心5 min，弃上清以洗去未结合的荧光单抗，流式细胞仪三色分析法检测细胞免疫表型。每份标本分析5000－6000个细胞。

2.4 细胞凋亡检测 培养24 h的淋巴细胞以结合缓冲液洗涤后调整细胞密度为1×106cells/L，加入AnnexinV－FITC和PI，流式细胞仪检测细胞凋亡。同时设立阴性对照。计数10000个细胞。

3 统计学处理

结 果

1 CD4+T淋巴细胞CD28的表达水平

流式细胞术三色分析法对新鲜分离的外周血淋巴细胞进行表型分析。RA组CD4+CD28－T细胞比例的均数明显高于健康对照组(7.79%±3.52%vs 1.89% ±1.78%，P＜0.05)，见图1。流式细胞术检测结果见图2。

2 淋巴细胞的凋亡率

对照组(即不加任何刺激剂进行培养的细胞)RA病人和正常人的淋巴细胞自发性凋亡水平无显著差异(4.23% ±1.96%vs 3.33% ±3.01%，P＞0.05)，实验组(加入PHA诱导淋巴细胞活化)RA组病人外周血淋巴细胞的激活诱导细胞死亡(activation－induced cell death，AICD)凋亡率显著低于健康对照组(11.38% ±5.73%vs 19.46% ±6.32%，P＜0.05)，见图3。

Figure 1.A significantly higher fraction of CD4+CD28－T cells was found in RA group compared with that in healthy control group.*P ＜0.05 vs healthy control group.n=50.图1 RA组与正常组CD4+CD28－T细胞比例对比

Figure 2.In isolated lymphocytes from human peripheral blood，CD4+T cells were analyzed CD28 expression by flow cytometry.A:the CD28 expression in CD4+T cells in a healthy control;B:the CD28 expression in CD4+T cells in a RA patient.图2 三色流式细胞术检测细胞表型结果

Figure 3.The apoptotic level in PHA－cultured lymphocytes was significantly lower in RA group than that in healthy control group.*P＜0.05 vs PHA+healthy control group.(RA group n=23;healthy control group n=24).图3 RA组与正常对照组淋巴细胞凋亡率比较

3 CD4+CD28－T细胞比例与淋巴细胞凋亡率的相关性

对RA组CD4+CD28－T细胞比例与淋巴细胞凋亡率进行 Spearman相关分析，结果显示 CD4+CD28－T细胞比例与外周血淋巴细胞AICD凋亡率呈负相关(r= －0.433，P ＜0.01)。

讨 论

RA以滑膜增生、慢性炎症和自身免疫进程为特征，其免疫病理事件涉及循环中大部分的T细胞［2］，因此，对外周血淋巴细胞的研究可能更能反映患者的整体病理状况。

CD28分子的触发是T细胞接受刺激活化完全所必需的［3］。由于CD28分子重要的协同刺激功能，CD28在CD4+T细胞上组成性表达。但近来多个研究发现，几种自身免疫疾病中，包括RA、韦格纳氏肉芽肿、风湿性多肌痛和强直性脊柱炎，外周血存在缺乏CD28表达的CD4+T细胞的扩增［4－8］。本研究通过流式细胞术三色分析法检测新鲜分离的外周血淋巴细胞 CD4+CD28－的比例，发现在 RA病人中，CD4+CD28－T细胞的百分比明显高于年龄相匹配的健康人(7.79% ±3.52%vs 1.89% ±1.78%，P＜0.05)，与国外报道的结果基本一致［4］。RA病人中的CD4+CD28－T细胞是T淋巴细胞中一个独特的亚群。近来研究已明确缺乏CD28表达的CD4+CD8－T细胞亚群，是免疫系统老化的一个最好的生物学指标［9－11］，但并不清楚知道T细胞可以完成多少个细胞循环。T细胞在经历多个细胞分裂循环后进入细胞衰老程序，细胞衰老有3个主要特征［12］:(1)功能的改变，例如产生大量的炎症细胞因子;(2)端粒长度的缩短，最终增殖停止;(3)对凋亡耐受。而细胞衰老最广为人知的表型改变是CD28的丢失。研究认为CD28－T细胞代表了衰老的淋巴细胞，其来自受抗原反复刺激的CD28+前体细胞［13］。因此，RA病人外周血T淋巴细胞可能在肿瘤坏死因子α(TNF－α)刺激下，CD4+T细胞丢失整合CD28起始区域的核蛋白，从而下调CD28在细胞表面的表达［14］。

本研究发现RA病人外周血中CD4+CD28－T细胞比例增高和淋巴细胞凋亡率降低的同时存在，使我们推测是否由于CD4+CD28－T细胞的凋亡耐受作用而促成了RA外周血淋巴细胞经历AICD时的凋亡率下降呢?当我们进行相关分析时，结果显示CD4+CD28－T细胞比例与淋巴细胞凋亡率之间存在负相关(r= －0.433，P ＜0.01)，提示 CD4+CD28－T细胞比例增多，可能由于它们具备对AICD抵抗的能力，从而促进了RA患者外周血活化淋巴细胞生存期的延长，并可能因此参与RA的发病机制。

由于在RA病人中CD4+CD28－T细胞的数目与他们的年龄不相符(明显高于年龄匹配的正常对照)，因此我们推测CD4+CD28－T细胞在RA的病理状态下代表过早衰老的T细胞，来自体内被抗原重复激活的CD28+前体细胞，而且，CD28的丢失伴随着其它新的致炎功能的获得并长期存活从而导致了疾病相关的免疫异常。这些异常T细胞募集到组织部位可能与局部炎症反应风险增高相关。自身耐受性需要一个功能齐全的免疫系统来鉴别自己和非己，可能由于异常T细胞亚群－CD4+CD28－T细胞的积聚，打破了机体的免疫平衡从而促成了RA的自身免疫表现。而RA病人存在过早的免疫衰老也为现有的临床治疗策略引进新思路，尤其是，考虑采用免疫重建代替全身性的免疫抑制治疗［15］。

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