三七总皂苷提取分离及分析方法研究进展

孟 琼，陈治宇

（承德医学院，河北承德 067000）

三七总皂苷（total saponins ofPanax notoginseng，PNS）是五加科人参属植物三七（Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen）的主要活性部位，含有多种单体皂苷，具有扩张血管、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、降血脂、抗炎、抗氧化等多种药理作用[1]。临床上主要用于心脑血管疾病的治疗。本文针对三七总皂苷的提取、分离、纯化以及分析方法的发展综述如下：

1 三七皂苷类成分的提取方法

大体分为两类，一类是传统方法，如渗漉法、浸渍法、水煎煮法等[2-4]，成本低廉，但提取效率较低；另外一类是近年发展起来现代仪器提取方法，提取效率高，提取完全，如加压溶剂萃取法（PLE,pressurized liquid extraction）[11]、微波萃取法[10]、超临界流体萃取法（SFE）[8,9]等。

三七总皂苷中各成分性质不尽相同，如三七二醇皂苷耐受高温，而三醇皂苷热敏性强，在煎煮温度大于60℃时，极易降解失效，因此本文主要介绍低温非加热条件下的提取方法。

1.1 冷浸法 Dong等[2]以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和黄酮类为指标，用正交设计法对三个因素做出了优化，得出三七根提取的最优条件：提取溶剂水，20倍量，浸提时间24h。在此种条件下提取出的三七总苷抗血小板聚集作用最强。

1.2 酸水解法 滕荣伟等[3]用温和酸（乙酸-乙醇1：1）在6h、60℃条件下水解三七药材粗粉，过制备液相色谱柱分离得到五种新的达玛烷型糖苷。酸水解法可以较为容易的提取出苷，但是酸水解选择性低，提取效率也低，水解不均匀，很容易将同一皂苷水解成不同的产物。

1.3 渗漉法 渗漉法是一种较好的提取方法，设备简单，操作安全，节能降耗，减少成分破坏，有煎煮法不可比拟的优点。闫光军等[4]用正交试验优化渗漉法提取三七皂苷的条件：15倍量的75%乙醇以5ml/min的速度渗漉为最佳提取方案。可提取出的三七总皂苷含量达11.01%,提取率为93.1%。认为已基本提尽，但是渗漉法耗时长，不适用于工业化大生产。

1.4 超声波提取法

1.4.1 单频超声：秦枫等[5]以三七总皂苷含量为指标，香草醛一高氯酸法测定其含量，对超声提取三七总皂苷（PNS）的提取工艺用正交设计优化，得出的最佳提取工艺为：料液比1:12，水饱和正丁醇超声提取2次，时间50min，温度40℃，提取率8%（原药材）。这种方法通过加速药物有效成分进入溶剂，提高了提取率，避免了高温破坏有效成分；料液比与回流提取工艺相近，但是提取时间大大缩短。

1.4.2 双频超声：贲永光等[6]采用双频超声（40kHz/25kHz）技术对三七总皂苷提取进行强化，用正交设计得出双频超声提取最佳工艺条件为：80%乙醇，提取时间30min，料液比为1:20，提取温度为40℃。得出提取率为82.41%，（有效部位）提取率高于40kHz或25kHz单频超声。

1.4.3 超声酶法：超声波提取法与生物酶提取法为现代中药有效成分提取的新方法，操作简便，工艺条件稳定。周琳等[7]考察了乙醇回流法、超声法、超声纤维素酶法、超声果胶酶法、超声复合酶法提取三七总皂苷的优劣,并采用四因素（纤维素酶用量、果胶酶用量、超声时间、加水量）三水平正交设计法对超声复合酶法提取工艺条件进行优选。结果得到了最优的提取工艺条件：pH4.5，酶解温度50℃，酶解时间为2h，纤维素酶用量15U/g（生药），果胶酶用量为140U/g（生药），超声时间90min，加水量8倍量。所得三七提取液中总皂苷的含量为10.33,提取物得率为35.17，显著高于乙醇回流法等传统方法。

1.5 超临界流体萃取

1.5.1 超临界CO2萃取法:黄雪等[8]通过正交实验对超临界提取工艺条件进行了优化：粉碎工艺适宜的萃取温度45℃,压力38MPa,CO2流量23kg/h,夹带剂300ml,萃取时间3.0h,提取率7.97%；轧胚工艺适宜的萃取温度45℃,压力35MPa,CO2流量20kg/h,夹带剂350ml,萃取时间2.5h,提取率9.98%。超临界CO2萃取技术具有萃取能力强、提取率高、生产周期短、有效成分不被破坏、工艺简单、操作参数容易控制、没有溶剂残留、产品质量稳定等优点，已经应用于中药有效成分的工业化大生产中。

1.5.2 超临界CO2反相微乳萃取:雷羽等[9]将表面活性剂二-（2-乙基己基）磺基琥珀酸钠（AOT）和水引入到超临界CO2中，形成反相微乳体系，从而提高对三七总皂苷的萃取能力。最高提取率可达16%以上，适用于工业化大生产。

1.6 微波萃取法 郭子杰等[10]优化了微波浸提三七皂苷的工艺条件，得出最佳条件为：微波辐射功率600W,微波辐射时间10min,料液比1:4,80%甲醇。并证明微波处理后的三七中皂苷物质的浸取速度至少是未经微波处理的4倍，大大提高了提取效率。此外，微波还会促使三七中的细胞壁破裂,有利于皂苷成分的溶出。但是，微波萃取也是因为规模小，目前还未见有用于工业化生产。

1.7 加压溶剂提取法（PLE） 李鹏等[11]以三七总皂苷、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1含量为指标，用单因素考察法对影响加速溶剂提取三七皂苷类成分的因素进行优化，得到的最优条件为：溶剂甲醇,药材粒径为0.3-0.45mm,提取温度150℃,提取压力6.895MPa。提取15min,提取1次，提取率与索氏提取相当，但能明显地缩短提取时间和溶剂用量，同时重现性也有明显的改善。加压溶剂提取是近年来发展起来的一种新型样品提取技术，具有提取时间短、溶剂消耗少、提取效率高、操作模式多样化以及操作过程自动化等诸多优点。尽管如此，由于其提取容量限制（11ml或33ml）,目前还不能用于工业化大生产，只能用于分析实验的样品制备。

1.8 罐组逆流提取法 陈勇等[12]以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、总皂苷和浸出物含量为优化目标，采用正交试验设计，利用回归分析方法建立了各优化目标与考察因素间的数学模型,结合方差分析得到三七罐组逆流提取（multi-stage countercurrent extraction,MCCE）最佳工艺参数：体积分数70%乙醇，8倍药材量溶剂，阶段提取时间30min,提取温度50℃。与其它提取工艺相比，MCCE在保证较高收率的前提下，温度可以降低50%左右，溶剂节省50%-70%,单位时间的处理量增大，使得有效成分最大限度地溶出，适用于工业化大生产。

1.9 水提取法 水提取法是以水为溶剂,应用生物酶、发酵、组合大孔吸附树脂、脱色树脂、离子交换树脂等现代科学技术从三七中提取、分离、精制、纯化三七总皂苷。王兴文等[13]用水提取法对三七中皂苷类成分提取的工业化大生产做了探索，建成日处理3000kg三七药材的生产线，提取率8%,含量95%以上。这种方法高效、环保，产品质优、稳定，可用于工业化大生产。

2 三七皂苷类成分的分离纯化方法

2.1 大孔吸附树脂法 万建波等[14]以人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rg3为指标，优化了大孔吸附树脂分离三七中原人参萜三醇（PTS）和原人参二醇（PDS）皂苷的条件，得出最佳分离树脂型号为DS-401, 从PLE提取液（含PTS22.5%、PDS16.4%）中的分离出88.2%PTS和92.6%PDS。大孔树脂由于其成分低廉，可以再生，在皂苷类成分的分离中较为常用。

2.2 高速逆流色谱法（HSCCC） 杜琪珍等[15]用正己烷-正丁醇-水（3:4:7）作为分离溶剂系统，从283mg三七皂苷甲醇提取物中分离得到57、17、13和56mg的人参皂苷Rb、三七皂苷R、人参皂苷Re和人参皂苷R。高速逆流色谱可在短时间内实现高效分离和分析，无固体载体,可以避免分离样品与固体载体表面产生化学反应而变性和不可逆吸附，对样品的预处理要求较低,适用于粗提取物的分离，但文中并没有与大孔吸附树脂比较提取率。

2.3 液相制备色谱技术 韩金玉等[16]采用正相液相制备色谱以大孔吸附树脂的精制物为原料，对三七叶皂苷进行分离，优化出最佳制备条件：流动相：正丁醇-乙酸乙醋-水=2:1:1（上层），流速40mL/min，适宜的上样量为10g,制备出含量达95%以上的人参皂苷单体Rb3。可以探索一下，用制备型液相来分离三七根和根茎中的皂苷类成分。制备型高效液相色谱是一种快速、有效的分析分离工具。这种方法只在三七叶的研究中有，不知道可否拓展到三七总皂苷的提取，况且这种方法也只能用于实验室。

3 三七皂苷类成分的色谱分析方法

三七总皂苷含有人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1,三七皂苷R1、R2、R3、R4、R6等20多种皂甙成分，其中以人参皂苷Rb1（35%）、Rg1（40%）、三七皂苷R1（15%）含量最高[17]。

3.1 高效薄层扫描法（HTLC） 万建波等[18]采用加压溶剂提取三七中皂苷类成分，高效薄层扫描进行含量测定，结果表明：人参皂苷Rb1、Rd、Rg1和三七皂苷R1的线性范围为0.402-2.010μg（r=0.9995），0.154-1.275μg（r=0.9965），0.198-1.980μg（r=0.9998），0.156-1.400μg（r=0.9978），回收率在95.3%-99.3%之间[18]。HTLC的优点是快速、直观，可同时分析多个样品，缺点是影响因素多，定量不准确。

3.2 高效液相色谱法（HPLC） 由于皂苷类成分没有共轭链，因此就没有紫外吸收，而蒸发光散射检测器（ELSD）是通用型检测器，可用于没有紫外吸收的药物。因此，万建波等[19]用HPLC-ELSD测定了用PLE提取的三七皂苷R1和人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的含量。梯度洗脱，能很好的分离人参皂苷中很难分离的Rg1和Re。

虽然皂苷类成分没有紫外吸收，但是用UV检测器的末端吸收也可以测出皂苷类成分。Lau等[20]用HPLC- UV法来测定生三七和蒸三七中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、20S-Rh1、20R-Rh1、Rd、Rk3、Rh4、20SRg3、20R-Rg3、Rk1、Rg5的含量。采用梯度洗脱，80min可以分离所有的皂苷类成分。

3.3 超效液相色谱法（UPLC） Eric等[21]用UPLC/TOF MS来测定生三七和蒸三七中皂苷类成分三七皂苷R1和人参皂苷Rb1、Rc、Rd、Re、Rg1，8min内就可测定6个皂苷，极大的缩短了分析时间。

3.4 毛细管电泳法 由于皂苷类成分不能电离产生电荷，因此不能用普通的毛细管点用来做，而要用带电荷的表面活性剂使其带电，从而达到分离分析的效果。王书芳等[22]用胶束毛细管电动色谱（MEKC），以10mM、pH2.4的H3PO4作为运行缓冲液，以140mM十二烷基硫酸钠（SDS）、20%乙腈和15%2-丙醇做初始缓冲液，十种皂苷（人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rd、Rc、Rb3、Rh1、Rg2、Rf和三七皂苷R1）达到很好的分离效果。

4 小结

三七皂苷类成分具有多种药理作用，在临床上需求广泛。目前，尽管关于三七皂苷类成分的提取、分离纯化的研究较多，但工业化生产中还是多采用加热回流-醇沉等传统方法，产品得率低，纯度不高，活性成分分析也仅限于几个含量较高的主要皂苷。本文针对三七皂苷类成分的提取分离及分析方法做一较全面的综述，随着研究手段的不断发展，肯定会不断涌现出更多方便、快捷、有效的研究方法，但每种方法各有其适用范围和针对性，在具体应用中应综合分析，或者选用多种方法相结合，以达到最佳效果。

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