四氯化碳复合、梯段用药法制备大鼠门脉高压模型的研究

徐义军 王超

(1.湖北省京山县人民医院普外1科 湖北荆门 448000;2.华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科 湖北武汉 430030)

大鼠门脉高压实验模型对研究该病的发生、发展、转归以及治疗具有着重要价值。自1936年Cameron和Karunaratn～e首次报道应用四氯化碳(CCl4)制作肝硬变门脉高压动物模型至今,人们对该法不断探索、改进和完善。基于此目的,我们对传统的制作方法进行改良,即采用复合法、分段用药,以求建立一种更加成熟、稳定可靠的模型制作方法,为进一步实验打下坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组 普通雄性SD大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)150g～170g/只,共95只。按编号法随机分为模型对照组(n=10)以及模型组(n=85)。

1.1.2 主要试剂 CCl4(分析纯,浓度为99.5%),橄榄油,新鲜配置的2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液(由华中科技大学同济医学院超微病理教研室提供),苯巴比妥钠,速眠新Ⅱ(军事医学科学院军事兽医研究所)。

1.1.3 实验准备 将CCl4与橄榄油溶液混合配制成40%、50%的溶液,大鼠适应性饲养,食水供应充足。温度控制在22℃(±)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 分为两期:诱导期和成模期[1]。(1)诱导期:实验动物在诱导前以每升蒸馏水中含0.35g苯巴比妥钠的溶液作为大鼠的惟一饮用水,时间为1周。饲料使用普通大鼠饲料。(2)成模期:模型组:按0.4mL/100g剂量予以背部皮下注射50%CCl4橄榄油溶液(即5份CCl4+5份橄榄油溶液,混匀),每周2次,持续4周。第5周开始改为50%CCl4橄榄油溶液,以0.5mL/100g标准背部皮下注射,每周2次,持续4周。对照组:按0.4mL/100g体重予以背部皮下注射橄榄油,每周2次,对照组给予普通饮水和饲料,频度及剂量同实验组。停药2周后即可成模,即制备门脉高压大鼠模型时间共计10周。

1.2.2 影像学检查 抽样部分模型大鼠采用速眠新Ⅱ麻醉后进行影像学(MR、CT)检查。

1.2.3 血流动力学指标测定 所有动物均在严格的无菌条件下进行手术。以1.0mL/kg体重肌肉注射速眠新Ⅱ麻醉大鼠[2],麻醉成功后,手术助手将大鼠以仰卧位固定于手术台上,剃除胸腹部毛发,常规消毒铺巾,术者穿手术衣,作剑突下正中切口约3cm,推开肝叶暴露门静脉主干,使用游标卡尺量取门静脉主干外径(D),注意手法轻揉,勿牵拉门静脉,以减少误差,结果以mm表示。暴露脾脏,将21G针头用肝素盐水冲洗后,刺入脾脏髓质,连接压力换能器和生理记录仪,以脊柱前缘为零点,间接测量门静脉压力(PVP),结果以mmHg表示。

1.2.4 肝脏病理学检查 取新鲜肝脏组织以2.5%磷酸缓冲戊二醛固定后送超微病理检查,以福尔马林溶液固定送HE、Masson染色检查。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 模型检验及存活情况

大部分实验动物在诱导过程中活动减少,精神萎靡,食欲不振,每日引水约25mL,对外界刺激反应迟钝,动物皮肤无光泽,腹水明显,体重下降;同期正常对照组大鼠饮食、精神和活动状态良好,;模型组大鼠CT、MR检查及肉眼观见大鼠体形消瘦,肝脏体积缩小,表面凹凸不平,脾脏略有增大,伴有肝周少量腹水;模型结束后存活61只大鼠,死亡率(28%,24/85)。

2.2 肝脏病理学改变

模型对照组HE染色见肝小叶结构完整,肝索排列整齐,肝细胞形态正常,Masson染色见汇管区无纤维组织增生,肝中央静脉周和肝血窦周偶见少量的网状纤维。模型组大鼠的肝组织发生了一系列病理学改变,可见炎性细胞浸润,纤维组织广泛增生,并破坏了肝小叶正常结构,并将其分割成大小不一、圆形或类圆形的肝细胞团,形成假小叶和小结节性肝硬变,但肝细胞再生不明显;电镜观察见肝细胞肿胀变性、坏死,粗面内质网短、小,肝窦间隙内充满大量胶原纤维,巨嗜细胞活化。

2.3 门静脉血流动力学指标变化

门脉高压模型组大鼠门静脉压力(PVP)、门静脉内径(D)较对照组明显增加(P<0.05),见表1。

3 讨论

肝硬化门脉高压动物模型在研究该病的发生、发展、转归以及治疗等方面的重要性是不言而喻的。CCl4诱发肝硬化门脉高压动物模型是一个较为经典的方法,染毒方法有经消化道、皮下注射或腹腔内注射等途径[3～4]。以使用小动物如大鼠为多,物模型较为稳定、可靠。为加快成模速度,可配合应用酶诱导剂,如乙醇、苯巴比妥等。1981年Chatamra采用50%CCl4、10%乙醇为主的多因素综合法来诱导大鼠肝硬化模型,诱导时间约12周,目前已成为一种标准的诱导方法。乙醇能增强CCl4毒性作用,且能直接损伤肝细胞线粒体。但也有作者认为该方法存在一定的缺陷,如动物模型形成周期长(12周)、形成率低(低于80%),部分大鼠还出现拒饮乙醇水导致脱水乃至死亡,因各种原因导致的死亡率甚至可超过30%。苯巴比妥可使细胞色素P-450活性增强,滑面内质网增生。细胞色素P-450是肝微粒体最重要的药物代谢酶,故合用苯巴比妥可增加肝细胞对CCl4的敏感性。在饮用水中加入苯巴比妥钠可促进大鼠产生持久的肝硬化。复合法动物肝硬化门静脉高压模型是目前最常用方法,可节约时间,提高成模率与降低死亡率。

表1 门静脉血流动力学指标

在此研究中,笔者先对实验大鼠进行苯巴比妥诱导,再对CCl4的用药浓度进行改进调整,即先用40%CCl4诱导4周,使大鼠对诱导药物产生一个耐受过程,再提高CCl4的浓度至50%,为了提高CCl4的吸收率同时并不增加急性中毒死亡率,以及不对后面的研究造成干扰,故采用皮下注射方法,共选择了85只SD大鼠,到第10周造模成功。我们通过HE染色、Masson三色染色证明,增生的纤维组织破坏了肝小叶正常结构,并将其分割成大小不一、圆形或类圆形的肝细胞团,形成假小叶和小结节性肝硬变,但肝细胞再生不明显。肝界板破坏,纤维条索向肝内延伸、分隔,亦压迫肝窦,使肝窦水平的阻力增高,从而引起门静脉系统血流动力学的改变。本研究通过对门静脉系统血流动力学的研究发现,门静脉直径增加,自由门静脉压力增高,实验组明显高于对照组。

综上所述,本实验成功地制备了大鼠肝硬化门脉高压模型,具有典型的肝组织学改变、明显的门静脉系统血流动力学改变。为以后的实验研究打下了基础。

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