定量PCR研究细粒棘球蚴抗氧化相关基因的差异表达*

侯秋莲,张富春,张文宝,吾拉木◦马木提,张壮志

2.新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐 830046;

3.新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐 830000

定量PCR研究细粒棘球蚴抗氧化相关基因的差异表达*

侯秋莲1,张富春2,张文宝3,吾拉木◦马木提1,张壮志3

目的在已构建的氧化胁迫下细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)与正常组织差异表达的消减cDNA文库中,筛选细粒棘球蚴在抗氧化过程中差异表达的重要基因。方法将前期研究中应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建氧化胁迫下细粒棘球蚴差异表达基因的消减cDNA文库进行蓝白斑筛选和菌落PCR分析后测序分析。测序结果利用BLAST在线软件与GenBank数据库进行同源序列比对分析和BlastX分析。从文库中随机挑选4个未知新序列和抗氧化密切相关的TPx基因片段,利用定量PCR法研究氧化胁迫下,差异表达基因片段在mRNA水平上的变化情况。结果整个文库克隆测序结果获得重要基因的cDNA序列,如氧化还原酶、蛋白激酶、生长因子等。另有部分克隆在GenBank中无法查到对应的同源基因,可能代表了新基因。定量PCR结果显示:S88、H32-1两个基因在0.8 mmol/L H2O2氧化胁迫的原头蚴中表达量分别上调为未经氧化胁迫原头蚴中的2.0和2.3倍,TPx基因片段当H2O2浓度大于0.8 mmol/L时,其表达量增高。结论上述基因的上调表达很可能与细粒棘球蚴在抗氧化过程中的相关功能有密切的联系,可以作为研究细粒棘球蚴抗氧化的候选基因。

细粒棘球蚴;氧化胁迫;抑制性消减杂交;荧光定量PCR;基因差异表达

2.新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐 830046;

3.新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐 830000

细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)是囊性包虫病的病原体,棘球蚴以包囊形式在人和其它中间宿主的内脏器官中生长,在其早期发育阶段,包囊自身和宿主的新陈代谢及对感染产生的免疫应答都会产生大量的不稳定的活性氧类物质(reactive oxygen species,ROS),ROS具有很高的反应性,能够对蛋白、膜脂和DNA造成直接的损伤,产生严重的生物学效应,当在机体内大量堆积时可导致细胞、组织的死亡〔1-2〕。1998 年,Salinas等〔3〕发现:在体外培养条件下,细粒棘球蚴的幼虫原头蚴(PSC)阶段可以代谢H2O2,而在其体内检测不到过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,因此推测细粒棘球蚴体内存在其它的抗氧化基因,保护机体免受氧化损伤过程中起着关键的作用,其对于棘球蚴在人和其它中间宿主内脏器官中存活是十分必要的。

在前期研究中〔4〕,构建了氧化胁迫下细粒棘球蚴与正常组织差异表达的消减cDNA文库,本研究应用real-time PCR技术,进一步对细粒棘球蚴在氧化胁迫下基因的mRNA水平差异表达进行研究,探究细粒棘球蚴在氧化诱导过程中相关靶基因的表达变化及其功能。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 标本来源 从新疆乌鲁木齐市屠宰场新鲜采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏,立即带回实验室,清洁脏器表面。在无菌条件下,用吸管吸取原头蚴,将其置于含有青链霉素的无菌PBS液中(pH 7.3),洗3次,离心后将沉淀加入1%pepsin(pH 3.0)中,于37℃消化30 min后,用吸管反复抽吸以破坏囊膜,使原头蚴从育囊中散出,同时用无菌PBS液漂洗3次除去育囊碎片,倒置显微镜下检查其活性,用含有10%牛血清的DMEM培养基无菌培养于37℃、5%CO2的细胞培养箱。培养24 h的原头蚴用于实验。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基(High Glucose)购自美国Gibco公司;T rizol试剂购自美国Invitrogen公司;标准胎牛血清FBS 、T4DNA 连接酶 、pMD18-T 载体 、DNA Marker、X-Gal、ExTaqDNA聚合酶均购自大连宝生物工程有限公司;PCR产物纯化试剂盒购自北京百泰克生物公司;DH5α大肠杆菌为本室保存;DNaseⅠ、逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagentKit(TaKaRaCode:DRR037S)、荧光定量 PCR 试剂盒 SYBR○RPremix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa Code:DRR041S)购自 TaKaRa公司;荧光定量PCR采用德国 Roche公司的 Lightcycler 1.5型荧光定量PCR仪,以及该公司生产的Real time PCR专用加样毛细管;其他试剂为国产分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 消减cDNA文库构建 见文献4。

1.2.2 消减cDNA文库的鉴定、测序与序列分析各取SSH文库中1μ L菌液作为PCR扩增模板,以pMD18-T载体多克隆位点两端通用引物进行菌落PCR扩增,证明含有插入片段后(200-1 000 bp),将整个文库送天根生化科技(北京)有限公司进行测序。将测序结果去除载体和引物序列以后,利用BLAST在线软件与GenBank数据库进行同源序列比对分析和BlastX分析。

1.2.3 差异表达基因的实时荧光定量PCR 根据测序分析结果,从文库中随机挑选4个未知新序列和抗氧化密切相关的TPx基因片段,设计定量PCR引物(表1),以ActinⅠ基因为参照标准进行定量分析。原头蚴进行不同H2O2浓度(0,0.8,1.6,2.4 mmol/L)的氧化胁迫处理24 h,总RNA的抽提采用 Trlzol试剂,用 RNase Free DNaseⅠ处理总RNA,以除去总RNA的DNA。

1.2.4 逆转录反应 采用TaKaRa公司的Prime-ScriptTMRT reagent Kit。反应体系为:模板2 μ L,5×PrimeScript缓冲液4 μ L,PrimeScript酶混合物1 μ L,Oligo dT 和 Random 6 mers 引物各 1 μ L,加RNase Free dH2O至总体系为20μ L。

1.2.5 Real time PCR反应 取相同量的逆转录产物进行PCR反应,real-time PCR反应采用TaKaRa公司的SYBR?Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time),按照说明书在冰上配制PCR反应液,每个样品重复3次。反应结束后确认 real-time PCR反应的扩增曲线和融解曲线。

表1 定量RT-PCR所用的基因特异性引物Table 1 Gene specific primers for quantitative RT-PCR

1.3 定量PCR数据处理 利用实时定量PCR分析基因在不同组织中的表达差异,目前常用的是相对定量法 ,多采用 2–ΔΔCt法〔5〕,确定特定荧光域值对应循环数的Ct值,对目标基因定量。

2 结 果

2.1 cDNA测序与序列分析初步结果 将消减cDNA文库送至北京天根公司,进行全文库单向测序扫描。根据GenBank数据库,将测序结果进行同源序列比对和BlastX分析,部分结果列于表2中。发现文库中有7个EST s序列在数据库中找不到同源片段,这7个EST可能代表了新基因。另有部分基因功能与氧化还原关系密切,如SSH-18、SSH-90等。

表2 部分阳性克隆BlastX分析结果Table 2 BlastXanalysis of the partialy clones

2.2 差异表达基因的实时荧光定量PCR分析 为了更准确地鉴定SSH文库中差异表达基因的可靠性,采用实时荧光定量PCR分析了5个EST在原头蚴经H2O2氧化胁迫处理和未处理对照中的差异表达情况,其中TPx为抗氧化基因家族中的一员,其余为功能未知基因。图1是对这些差异表达基因3个重复样品的解链曲线分析。从图中可以看出,随着温度的升高,与双链DNA结合的荧光染料SYBR GreenⅠ逐渐被释放,曲线均无杂峰出现,说明实验过程中无样品污染和引物二聚体,扩增产物单一,确定为特定的片段。

图1 部分差异表达EST的融解曲线分析Fig.1 Melting curve analysis of differential expressed ESTs A:Differential expressed EST of TPx;B:Differential expressed EST of S88 and H32-1;C:Differential expressed EST of O68 and D12.

2.3 差异表达基因的数据整理 目标基因与内对照基因(ActinⅠ)Ct值的差值(△Ct)列于表3、表4中。S88、H32-1两个基因在0.8 mmol/L H2O2氧化胁迫的原头蚴中表达量分别达到了未经氧化胁迫原头蚴中的2.0和 2.3倍,在2.4 mmol/L H2O2氧化胁迫的原头蚴中,这两个基因的表达量分别达到了未经氧化胁迫原头蚴中的8.0和6.1倍。

表3 S88基因相对表达分析Table 3 The fold change in expression of the S88 gene relativeto the internal control gene(ActinⅠ)

表4 H32-1基因相对表达分析Table 4 The fold change in expression of the H32-1 gene relative to the internal control gene(ActinⅠ)

3 讨 论

逆境压力会刺激细胞产生氧化自由基,过量的氧化自由基却会导致细胞走向凋亡〔6〕。当机体处于应激条件时,体内ROS产生增加,体内的抗氧化系统作用增强〔7〕。

基因的表达量基因定量过氧化氢作为细胞内信号分子,它可以与信号通路中蛋白质的巯基反应,使之活化或失活,参与信号转导。在哺乳类动物,胞间氧化还原状态与细胞分化、免疫应答、生长控制、肿瘤发生和细胞凋亡都有着密切联系〔8-9〕。囊型包虫病呈世界性分布,其流行已成为全球性的公共卫生问题〔10-11〕。寄生虫通过合成抗氧化酶并大多在宿主—寄生虫的接触面表达以适应及抵抗氧化胁迫的压力〔12-13〕。抗氧化酶在保护寄生虫抵御来自宿主新陈代谢和白细胞激活的ROS的氧化损伤起关键作用〔14〕,提示细粒棘球蚴具有抵抗氧化的机制。

在前期研究中〔4〕,对SSH技术在寄生虫研究领域的应用进行了尝试,构建了H2O2胁迫PSC与正常组织差异表达的消减cDNA文库。本研究进一步对实验分离克隆到一些重要基因的cDNA序列进行分析,这些基因编码的产物功能可以大致分为两类:第一类是功能蛋白类,在细胞内可直接发挥保护功能,如氧化还原酶。第二类是调控蛋白类,在各种胁迫反应的信号转导或基因表达中起调节作用,间接起保护作用,如蛋白激酶、生长因子等。蛋白激酶在胁迫信号感应和转导中有重要作用〔15〕。另有部分克隆在GenBank中无法查到对应的同源基因,这些可能代表了新基因。

Real-time PCR检测结果发现,本研究所构建的 SSH 文库中 ,S88、H32-1 、TPx 、D12、O68 、I36、P72、I39、F21、H32-2 基因都是受 H2O2诱导的,而且随着H2O2浓度不同,其表达量也有变化。当H2 O2浓度为2.4 mmol/L时,表达量为最高,说明随着H2O2浓度的升高,该部分基因的表达可以持续增强。其中,S88、H32-1基因的表达变化量分别为未经H2O2处理对照的8.0倍和6.1倍。由此说明所构建的SSH文库有效地富集了原头蚴经氧化胁迫特异表达的基因,可以进一步通过反向杂交手段筛选影响原头蚴抗氧化功能的主效基因。推测,S88和H32-1等几个新EST表达量的提高与原头蚴的抗氧化功能密切相关,可以进一步把它们作为原头蚴抗氧化的候选基因来进行更深层次功能的研究。而对于TPx基因表达变化差异,在经过H2O2浓度为0.8 mmol/L处理时,其表达量表现有下降,当H2O2浓度增高大于0.8 mmol/L时,其表达量又增高。Real-time PCR检测TPx表达量在经过H2O2浓度为0.8 mmol/L处理后和对照组表达差异不大,其原因如何,还需要进一步探讨。

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The differential expression of the anti-oxidation related genes inEchinococcus granulosusby real-time PCR

HOU Qiu-lian,ZHANG Fu-chun,ZHANG Wen-bao,MAMUTI Wulamu,ZHNAG Zhuang-zhi
(Basic Medicine College of Xinjiang Medical University,Urumqi830054,China)

To isolate the specific genes in protoscoleses(PSC)ofEchinococcusgranulosusunder oxidative stresses from the SSH library constructed in the previous study,the gene expression in PSC under oxidative stresses was studied by using real-time PCR.The previously amplified library was sequenced and analyzed in GenBank with Blast research.Sequence analysis indicated that all clones in the SSH library contained the coding sequences,of which some clones showed homology in the Gen-Bank and others were unknown.Differential expression of 4 genes randomly selected and the TPx gene in this library were studied with real-time PCR.It was demonstrated that the gene expression of S88 and H32-1 in oxidative tissues was 2.0 and 2.3 times higher than the un-oxidative stresses respectively.The TPx gene was up-regulated when PSC was induced with H2H2of more than 0.8 mmol/L.These results implies that the up-regulated expression of the above-mentioned genes may be related with the related functions of anti-oxidative process in PSC and they may be used as the candidate genes for the study of anti-oxidation ofE.granulosus.

Echinococcusgranulosus;oxidative stress;suppression subtractive hybridization;real-time PCR;dfferentially expressed gene

R383.33

A

1002-2694(2010)01-0001-05

*美国国立卫生研究院 R03基金资助项目(No.R03AI063367-01),国家自然科学基金项目(30760229),新疆教育厅创新群体资助项目(No.XJEDU2004G02)

吾拉木◦马木提,Email:mwulamu@hotmail.com

1.新疆医科大学基础医学院病原学教研室,乌鲁木齐830054;

2009-04-30;

2009-11-22