γ-干扰素试验及比较皮试在结核污染牛群的应用研究*

张喜悦,呼西旦,杨经纬,曹 瑞,黄保续,范伟兴

2.新疆牧科院兽医研究所,乌鲁木齐 830000

γ-干扰素试验及比较皮试在结核污染牛群的应用研究*

张喜悦1,呼西旦2,杨经纬1,曹 瑞1,黄保续1,范伟兴1

目的引进了国外的牛结核病γ-干扰素试验和比较变态反应,与我国常用单纯颈部变态反应试验进行比较,评价不同检疫方法的优缺点。方法5个结核污染牛群的167头牛同时用牛结核病γ-干扰素试验和比较变态反应进行检测,其中的106头牛用于其他变态反应方法的比对。结果167头牛中,γ-干扰素试验和国外比较变态反应检出阳性符合数为89头,阳性符合率为92.7%(89/96);106头牛中,国产牛型结核菌素(PPD)检与国外牛型PPD检出的阳性符合数为78头,阳性符合率为93.41%(78/83.5),国内常规皮试检出阳性牛84头,阳性率为79.25%(84/106),国外常规皮试检出阳性牛66头,阳性率为62.26%(66/106),国内比较变态反应与国外比较变态反应之间的阳性符合数为59头,阳性符合率为92.19%(59/64)。结论证实γ-干扰素试验和国外比较变态反应之间具有较好的阳性符合率,国内牛PPD与国外牛PPD试验结果相似,但国内常规皮试的特异性很低,而将国内皮试改进为国内比较皮试,则与国外常规的比较皮试具有较好的阳性符合率。

牛结核;γ-干扰素;比较变态反应

牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种牛的慢性消耗性传染病,该病可以传染给人类〔1〕。近年来,我国的牛结核疫情加重,严重威胁着人类的健康〔2〕。我国大多数牛场都是用单纯的牛型提纯结核菌素(PPD)颈部皮肤变态反应来进行牛结核检疫的,如果结果是阳性,则要进行隔离或扑杀。但是很多被扑杀的阳性牛,没有任何可见的病理变化,对牛结核检疫造成了很大阻力。

在很多发达国家,通常使用比较变态反应和γ-干扰素试验进行检疫。比较变态反应在国外已经具有很长的应用历史了,如英国、加拿大、美国、澳大利亚和新西兰等国家〔3-7〕,均采用比较变态反应作为扑杀结核阳性牛的试验依据,并有相关的法案规定强制执行。牛全血干扰素试验是牛结核诊断的一种新型的牛结核诊断方法,很多学者对其进行深入的研究。目前,该方法在欧盟和美国等发达国家已经得到了承认〔6-8〕,成为继变态反应之外的唯一的法定活畜诊断试验。我们将该方法引进中国,并与国际上通用的比较变态反应和我国常用的单纯颈部牛型结核菌素PPD皮试进行比较,从而为改进我国的牛结核检疫方法积累数据。

1 材料与方法

1.1 PPD与试剂盒 国产牛PPD购于黑龙江省生物制品一厂。比较变态反应试剂和 BOVIGAMTM牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒均为荷兰产品。

1.2 试验用牛 中国西部地区5个大的牛群,用国标方法进行检疫后,隔离阳性牛或其紧密接触者,分别组成了5个新的牛结核隔离牛群,共计167头活畜。

1.3 γ-干扰素试验

1.3.1 抗原刺激 每头牛采集5mL血液肝素抗凝血液,室温下于30h内运送到实验室。将采集的每份抗凝全血各取1.5mL加入3个不同孔中,然后取100μ L的牛型PPD、禽型PPD和阴性对照磷酸盐缓冲液(PBS),分别加入至抗凝全血中,混匀后于含5%CO2的培养箱中37℃培养16h。用移液器小心吸取培养的上清,转入至1.5mL离心管中,即为刺激产生的 γ-干扰素上清。这些上清可以立即用ELISA进行检测,也可以冷冻保存,待时间方便后再进行检测。

1.3.2 牛γ-干扰素酶联免疫吸附试验(ELISA)

单抗包被板上每孔加入50μ L样品稀释液,然后加入50μ L待测样品或对照,混匀后室温作用1h;洗涤,每孔加入100μ L酶标抗体,室温作用1h;洗涤后每孔加入100μ L底物,室温避光作用 30min后,加入终止液,测定OD450nm值。当牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1,且牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值≥0.1是为阳性,反之为阴性。

1.4 国内单纯颈部变态反应试验 参照依据中华人民共和国国家标准《动物结核病诊断技术(GB/T 18645-2002)》进行,仅用牛型PPD在牛颈部进行变态反应试验,剂量为2000国际单位(IU),注射前测量皮肤厚度,注射后72h再次测定皮肤厚度,皮厚差大于3mm时判为阳性,反之为阴性。

1.5 国外进口试剂比较变态反应试验 在牛颈部同时注射国外的牛型和禽型PPD,国外牛型PPD注射方法参照国标方法进行,国外禽型PPD注射位点在牛型PPD下方间隔越10～15cm处。注射前要先剪毛,在牛型和禽型PPD注射位点处均要测定皮肤厚度。72h后,在牛型和禽型PPD注射位点处均要重新测定皮肤厚度。如果牛型PPD的皮厚差大于禽型PPD的皮厚差且超过3mm判为阳性,反之为阴性。牛型和禽型PPD使用剂量均为2000IU。1.6 γ-干扰素检测方法与国外比较变态反应的比对试验 167头牛同时用国外比较变态反应和γ-干扰素试验对其进行检测。比较这2种方法的敏感性和特异性。

1.7 γ-干扰素检测方法与牛型PPD单纯颈部变态反应的比对试验 167头牛均同时进行了γ-干扰素检测试验和比较变态反应试验。单独计算比较皮试中牛型PPD的72h皮厚差,作为牛型PPD单纯颈部变态反应,按照国家标准判定结果,并与γ-干扰素检测方法进行比较。

1.8 其他变态反应之间的比对试验 167头牛中的106头牛,用于其他变态反应之间的比对试验。具体实验为颈部左侧注射国产国产牛型PPD,另一侧用国外比较变态反应,即上三分之一注射国外牛型PPD,下三分之一注射国外禽型PPD。

1.8.1 国产与国外牛PPD的比对 比对左侧国产牛型PPD和右侧上三分之一国外牛型PPD的试验结果,以评价国产牛型PPD的应用效果。

1.8.2 国内与国外常规检疫方法的比对 比对左侧国内常规变态反应试验和右侧国外比较变态反应的实验结果,以评价我国常规方法的应用效果。

1.8.3 国内比较变态反应与国外比较变态反应之间的比对 综合左侧国产牛型PPD和右侧下三分之一国外禽型PPD的实验结果为国内比较变态反应,与右侧的国外比较变态反应进行比对,评价国内比较变态反应的应用效果。

1.9 牛分枝杆菌的分离 扑杀比较变态反应和干扰素试验均为阳性的2头牛,取病变组织进行细菌分离,以部分验证比较变态反应和干扰素试验准确性。

2 结 果

2.1 γ-干扰素检测方法与国外比较变态反应的比较试验 167头牛同时应用γ-干扰素试验和国外比较变态反应进行检测,结果均检出阳性牛96头,阴性牛71头,2者的阳性检出率均为57.49%(96/167)。2者之间的阳性符合数为89头,阳性符合率为92.7%(89/96)。如果以比较变态反应作为金标准,96头比较变态反应阳性牛中,γ-干扰素试验检出的阳性牛为 89头,γ-干扰素试验的敏感性为92.71%(89/96);71头比较变态反应阴性牛中,γ-干扰素试验检出的阴性牛为64头,特异性为90.14%(64/71,见表1)。证实与比较变态反应相比,干扰素试验具有较好的敏感性和特异性。

2.2 γ-干扰素检测方法与牛型PPD单纯颈部变态反应的比较试验 167头牛同时进行γ-干扰素检测试验和牛型PPD单纯颈部皮试。结果γ-干扰素检测试验检出阳性牛96头,阳性检出率为57.49%(96/167);国内常规单纯牛型PPD颈部皮试检出阳性牛121头,阳性检出率为72.45%(121/167);国内常规牛型PPD单纯颈部皮试的阳性检出率明显高于γ-干扰素检测试验。证实国内常规牛型PPPD单纯皮试与干扰素试验相比特异性较差。这主要是由于部分牛型PPD阳性牛,在γ-干扰素试验中禽型PPD刺激上清的检测中也为阳性,从而使这些样品在γ-干扰素试验中最终检测为阴性结果。而一般认为,禽型PPD阳性是由禽分支杆菌等引发的非特异性反应,因此证实γ-干扰素试验可以排除一部分非特异性反应,见表2。

表1 γ-干扰素试验和比较变态反应的比较试验结果(单位:头)Table 1 Comparative result of IFN-γ and comparative skin test

表2 γ-干扰素试验与牛型PPD皮试的比较试验(单位:头)Table 2 Comparative result of IFN-γand single skin test

2.3.1 国产与国外牛PPD的比对 106头牛中,国产牛型PPD检出阳性数为84头,阳性率79.25%(84/106);国外牛型PPD检出阳性牛83头,阳性率为78.3%(83/106),两者具有相近的阳性检出率。2者之间的阳性符合数为 78头,阳性符合率为93.41%(78/83.5),见表3。证实2者具有较好的阳性符合率。

2.3.2 国内与国外常规检疫方法的比对 106头牛中,国内常规变态反应检出阳性牛84头,阳性率为79.25%(84/106);国外常规的比较变态反应方法检出阳性牛66头,阳性率为62.26%(66/106)。国内常规试验的阳性检出率明显高于国外常规实验阳性检出率。如果以国外比较变态反应方法为金标准,66头国外皮试阳性牛中,国内皮试阳性牛为63头,敏感性为95.45%(63/66);40头国外皮试阴性牛中,国内皮试阴性牛19头,特异性为47.5%(19/40),见表4。证实国内皮试的特异性很低。

表3 国产PPD与国外PPD的比较试验(单位:头)Table 3 Comparative result of bovine PPD of China and bovine PPD of Holland

表4 国内常规变态反应与国外比较变态反应的比较(单位:头)Table 4 Comparative result of single cervical test of China and comparative skin test of Holland

2.3.3 国内比较变态反应与国外比较变态反应之间的比对 106头牛,国内比较变态反应检出的阳性牛为62头,阳性率为58.49%(62/106);国外比较变态反应检出的阳性牛为66头,阳性率为62.26%(66/106)。2者具有相似的阳性检出率,它们之间的阳性符合数为59头,阳性符合率为92.19%(59/64),见表 5。

表5 国内与国外比较皮试的比较试验结果(单位:头)Table 5 Comparative result of comparative skin test of China and comparative skin test of Holland

2.4 牛分枝杆菌的分离 从扑杀的2头阳性牛病变淋巴结中,分离出了2株分枝杆菌,经多重PCR鉴定为牛结核分枝杆菌,部分证实了比较变态反应和干扰素试验的准确性。

3 讨 论

3.1 关于牛结核活畜检疫中的方法选择问题 牛结核病的诊断方法主要有病原学诊断和免疫学诊断。病原学诊断包括传统的细菌学检测和分子生物学诊断技术。细菌学检测在发达国家常作为诊断牛结核的确诊试验〔3〕,但由于分支杆菌生长缓慢,该方法需要耗费较长时间才能做出诊断。很多科学家建立了PCR用于诊断牛结核〔9-10〕,但试验结果均认为其敏感性较差,这可能与体内分支杆菌的繁殖特征有关。而且这些方法大多需要采集死亡家畜的病料来检测,因此病原学诊断并不适合大规模的活畜检疫。牛结核的免疫学诊断方法包括细胞免疫学诊断方法和抗体检测方法,由于牛结核的免疫以细胞免疫为主,注定了抗体检测方法较低敏感性,因此目前临床上使用最为广泛的只能是是细胞免疫学诊断方法。

3.2 关于国内常规牛型PPD变态反应 我国大多数牛场只是利用单纯的牛型PPD进行颈部皮肤试验,检出阳性牛即进行扑杀或隔离,但该方法在我国的应用并不理想。我们将国际上较为先进的γ-干扰素试验和常用的比较变态反应试验引入我国,并与我国常用的牛型PPD皮试进行了比较。结果单纯的牛型PPD皮试,与国外通用的比较变态反应和γ-干扰素试验相比,其特异性很差。这是由于比较皮试和γ-干扰素试验剔除掉的一部分禽型PPD阳性牛,在单纯的牛型PPD皮试中多为阳性。

3.3 关于干扰素试验 牛γ干扰素试验被认为是除变态反应以外的最具有应用前途的一种新型试验方法,已经成为很多发达国家的法定牛结核检疫方法〔6-8〕。我们的试验认为,与比较变态反应试验,γ-干扰素试验具有较好的敏感性和特异性,且与比较皮试具有很好的符合率。该方法可以在实验室内进行,判定结果更为客观,而且与皮试相比,试验所需时间较短。同时,该方法还可以同布病检疫结合起来,一次抽血可以同时检测2种疾病。因此,γ-干扰素试验在牛结核检疫中具有广阔的应用前景。但该方法也存在着很多缺陷,主要是成本偏高,而且需要较高水平的实验室才能进行操作。

3.4 关于比较变态反应 发达国家均以比较变态反应作为扑杀结核阳性牛的依据〔4-6〕。我们的试验也证实,国内比较变态反应可以剔除一部分禽型PPD阳性牛,而通常认为禽型PPD阳性是由禽分支杆菌等引发的非特异反应。与国外通用的比较变态反应相比,国内比较皮试具有较高的敏感性和特异性,而且与国外比较皮试具有较好的符合率(92.19%)。因此国内比较变态反应在不降低敏感性的同时,完全可以提高我国牛结核检疫的特异性。

3.5 关于禽型PPD的阳性率 5个牛群禽型PPD阳性率由3.2%到34.7%不等,似乎是牛PPD阳性率越高,禽型PPD阳性率越低,但这需要更多的数据来证实。但该结果影响了我们最初对干扰素试验敏感性的判断。因为当牛场具有较低阳性率的时候,我国常规牛型PPD检疫方法与γ-干扰素试验及比较变态反应的符合率均较差。同时如果以常规牛型PPD检疫方法来判定,γ-干扰素试验的敏感性又过于底下。但当牛场的阳性率较高时,这些方法就具有了较好的符合率。

3.6 本试验的不足 国外通常扑杀变态反应阳性牛,取病变组织或淋巴结进行细菌培养来确诊牛结核病,并确定试验的阳性牛。我们由于扑杀经费不足,不能扑杀阳性牛,所以不能确定被检牛群的阳性组,只能确认该牛群为结核阳性牛群,即结核污染牛群,而且本实验主要是不同方法在结核污染牛群中的应用,因此也未涉及结核阴性牛群,这需要我们下一步的工作进行补充。国外常以细菌培养作为金标准,同样由于经费的原因,本研究只能扑杀2头牛,培养部分牛分枝杆菌,以验证其他检疫方法的准确性。

〔1〕世界动物卫生组织.哺乳动物、禽、蜜蜂 A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册〔M〕.北京:中国农业出版社,2002:337-349.

〔2〕Xiuyun J,Chunfang W,Zhaoyang H.Cloning and expression of My cobacteriumbovis secretedproteinMPB51 in Escherichia coli〔J〕.Acta Microbiologica Sinica,2005,45:298 – 300.

〔3〕罗伯特.澳大利亚根除牛布鲁氏菌病和结核病纪实〔M〕.北京:中国农业出版社,2007:87-108.

〔4〕Vordermeier H M,Brown J,Cockle PJ,et al.Assessment of cross-reactivity betweenMycobacterium bovisandM.kansasiiESAT-6 and CFP-10 at the T-cell epitope level〔 J〕 .Clin Vaccine Immunol,2007,14(9):1203-1209.

〔5〕Chambers M A,Jahans K,Whelan A,et al.Glyn Hewinson R.Simple objective measurement of the cutaneous delayed-type hypersensitivity reaction to tuberculin using spectrophotometry〔J〕.Skin Res Technol,2002,8(2):89-93.

〔6〕United States Department of Agriculture.Bovine tuberculosis eradication uniform methods and rules〔M〕.New York:Law Press,2005:14-19.

〔7〕Liebana E,Johnson L,Gough J,et al.Pathology of naturally occurring bovine tuberculosis in England and Wales〔J〕.Vet J,2008,176(3):354-360.

〔8〕Buddle BM,Ryan TJ,Pollock JM,et al.Use of ESAT-6 in the interferon-gamma test for diagnosis of bovine tuberculosis following skin testing〔J〕.Veterinary Microbiology,2001,80:37-46.

〔9〕Michael T,Danny R,Worth,S P,et al.Rapid detection ofMycobacterium bovisDNA in cattle lymph nodes with visible lesions using PCR〔J〕.BMC Vet Res,2007,6:1-11.

〔10〕Hé nault S,Karoui C,Boschiroli ML.A PCR-based method for tuberculosis detection in wildlife〔J〕.Dev Biol,2006,126:123-132.

Application of interferon-γtesting and the comparative cervical skin test in herds infected withMycobacterium bovis

ZHANG Xi-yue,HU Xi-dan,YANG Jing-wei,CHAO rui,HUANG Bao-xu,FAN Wei-xing
(China Animal Health&Epidemiology Center,Qingdao266032,China)

The interferon-γtesting and the comparative cervical skin test were compared with the simple cervical hypersensitivity test routinely used in our country in herds infected withMycobacterium bovis,in which 167 infected cattle from 5 herds were tested with interferon-γtesting and the comparative cervical test(CCT)simultaneously and other 106 cattle were tested with other hypersensitivity tests used as control for comparison.In these 167 cattle tested with both tests,89 cattle were proved to be positive both in interferon-γtesting and CCT using the bovine PPD of Netherland with a coincidence rate of 92.7%(89/96).In 106 cattle the coincidence rate of positive reactions detected by γ-interferon test and CCT was 93.41%(78/83.5),that detected by the routine skin of foreign country was 62.26%(66/106);and that between the hypersensitivity test of China and foreign country was 92.19%(59/64).It is obvious that the interferon-γtesting and CCT seem to have higher coincidence rate and the specificity of the skin tests used in our country was rather low.Consequently,the use of the comparative cervical skin test should be considered to replace the routinely used shin tests.

bovine tuberculosis;IFN-γ;comparative cervical test

S855.2

A

1002-2694(2010)01-0053-04

*国家科学技术部863项目(2007AA022405)

范伟兴,Email:fwx sjl@126.com

1.中国动物卫生与流行病学中心,青岛 266032;

2.新疆牧科院兽医研究所,乌鲁木齐 830000

2009-05-18;

2009-09-19