低密度脂蛋白受体相关蛋白2结合蛋白在心脏特异转基因小鼠中引起的心脏功能代偿

张丽，全雄志，董伟，王书美，张晓娟，葛文平，高珊，张连峰

(中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

研究报告

低密度脂蛋白受体相关蛋白2结合蛋白在心脏特异转基因小鼠中引起的心脏功能代偿

张丽，全雄志，董伟，王书美，张晓娟，葛文平，高珊，张连峰*

(中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

目的建立心脏特异表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白2结合蛋白(Lrp2bp)转基因小鼠，研究该基因在心肌病发病中的作用。方法克隆鼠源Lrp2bp基因入α－MHC启动子下游，构建a－MHC－Lrp2bp表达载体，显微注射法建立Lrp2bp转基因小鼠。PCR鉴定转基因首建鼠的基因型。Western blotting鉴定Lrp2bp在心脏中的表达，心脏超声检测转基因鼠及野生型小鼠心脏结构和功能，透射电镜观察心肌细胞的超微结构改变。结果得到了4个Lrp2bp转基因品系，其中3个品系心脏Lrp2bp蛋白表达量与同龄野生型鼠相比明显增加。1 M龄转基因小鼠与同窝阴性对照小鼠相比，心壁变厚，心腔变大，射血分数和短轴缩短率下降。结论心脏特异表达的Lrp2bp基因能引起心肌肥厚表型，可能是参与心肌代偿性肥厚的基因之一。

Lrp2bp;转基因小鼠;心脏;代偿

低密度脂蛋白受体相关蛋白2结合蛋白(LDL receptor－related protein 2 binding protein，Lrp2bp)，又称兆蛋白结合蛋白，是一种新型的具有四肽重复序列的支架蛋白，功能尚不明确，可能作为接头分子，通过与兆蛋白结合，捕捉和释放转录因子，参与转录调节［1］。

本实验室建立的cTnTR92Q转基因小鼠心脏变大，室壁变厚，心腔变小，心肌细胞排列紊乱，间质纤维化，心肌舒张功能失调［2］;cTnTR141W转基因小鼠全心扩大，室壁变薄，间质纤维化，心肌收缩功能失调［3，4］。两者分别表现出典型的肥厚型和扩张型心肌病病理表型。两种疾病模型动物心脏基因表达芯片结果显示，Lrp2bp在扩张型心肌病动物模型心肌中mRNA显著上调表达，而在肥厚型心肌病动物模型心肌中表达较少，Lrp2bp可能参与心肌病发生发展。

1 材料和方法

1.1 材料

α－MHC Clone 26载体来自Baylor Medical College，Schinider Lab。Trizol提取液、Superscript. First－Strand Synthesis System for RT－PCR均购自Invitrogen。QIA quickGel Extraction Kit Protocol购自QIAGEN(德国)。限制性内切酶Sal I和Not I购自TaKaRa公司(日本)。所有引物由上海生工公司合成。测序由北京诺赛基因公司完成。Lrp2bp多克隆抗体、Western Blotting化学发光试剂为Santa Cruz公司(美国)产品。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥。HRP－GAPDH内参购自上海康成。C57BL/6J和ICR小鼠购自北京康蓝生物技术有限公司［SCXK(京)2004－0001］。显微注射仪为Nikon TE2000－U，倒置显微镜为Olympus(日本)产品。Vevo770小动物超声探测系统购自加拿大VisualSonics公司。

1.2 RT-PCR

Trizol法提取小鼠心脏总RNA，用Superscript III reverse transcriptase试剂盒的方法将2 μg RNA用随机引物逆转录合成cDNA第一链。跨外显子设计Lrp2bp基因片段PCR引物，以1 μL cDNA链为模板进行PCR，上游引物为:5’－CTATTTTGAAGAGGGCTGGT－3’，下游引物为:5’－AATGCCAGAAAAATGCCTT－3’。PCR反应体系20 μL。反应条件:94℃预变性3 m in，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，24个循环。琼脂糖电泳分析PCR产物，目的基因Lrp2bp片段为392 bp。

1.3 L rp2bp表达载体的构建及转基因

提取小鼠心脏总RNA，用RT－PCR扩增小鼠Lrp2bp全长cDNA，将扩增片段插入pMD18T载体，经测序并比对正确无突变碱基后，以Sal I酶切回收Lrp2bp片段，并克隆入α－MHC启动子下游构建心脏特异Lrp2bp表达载体，用Not I将其线性化，Sephedex G50柱纯化DNA片段，注射前将转基因片段的浓度调整至5 ng/μL，用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠［5］。实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准(GC－08－2032)。

1.4 PCR鉴定L rp2bp转基因小鼠的基因型

转基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组DNA［6］，用PCR法对转基因小鼠进行基因型检测。引物及反应条件和RT－PCR相同，30个循环。

1.5 W estern blotting鉴定L rp2bp蛋白的表达

提取F1代阳性转基因小鼠及同窝阴性小鼠的心脏总蛋白，进行SDS－PAGE凝胶电泳，将蛋白条带转移到0.45 μm硝酸纤维素膜上，置于5%的脱脂奶粉封闭液中，室温1 h，加入TBST稀释的的兔抗Lrp2bp多克隆抗体(1∶200)，4℃孵育过夜，用TBST洗膜三次，每次10 m in。然后加入1∶15 000辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，室温杂交1 h。采用HRP－GAPDH作为内参，弃去二抗，TBST洗膜三次，每次5 min，TBS洗膜一次，10 m in。将膜置于化学发光剂中，用X线胶片曝光。

1.6 超声检查Lrp2bp转基因小鼠

选用不同月龄的转基因阳性和同窝阴性小鼠，饱和三溴乙醇麻醉，选用30 Hz的探头，进行心脏超声影像分析［7］。

1.7 电镜超微结构

取部分左心室心脏组织固定于2.5%戊二醛(PBS，pH 7.4)固定液中，1%锇酸固定1 h，梯度乙醇脱水，环氧树脂Epon 812包埋。乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色后在透射电镜下观察，数码相机拍摄图片。

2 结果

2.1 RT-PCR验证基因芯片结果

本室3月龄cTnTR92Q和cTnTR141W转基因小鼠心脏总RNA的全基因表达芯片(Mouse Expression Array430 sets)，结果显示，Lrp2bp在两种转基因小鼠心脏中表达差异较大，故采用RT－PCR方法进行验证(图1)。

2.2 L rp2bp基因在野生小鼠组织的表达谱

提取一月龄野生小鼠心、肝、脾、肺、肾和脑六种组织总蛋白，Western blotting分析Lrp2bp在各组织中的表达。结果显示，Lrp2bp主要在成年小鼠肾脏组织中表达，肝、脾中表达较高，心、肺和脑组织中表达量少(图2)。

2.3 L rp2bp表达载体的构建

用RT－PCR法克隆的Lrp2bp基因，测序结果表明克隆的cDNA同已报道Lrp2bp序列完全一致(GenBank No.NM_026278)，将Lrp2bp基因插入心脏特异表达的α－MHC启动子的下游，构建Lrp2bp转基因表达载体(图3)。

2.4 转基因小鼠基因表型的鉴定

用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，转入到假孕受体ICR小鼠中，小鼠出生后9～14 d提取基因组DNA，用PCR检测Lrp2bp转基因小鼠(图4)，共得到4只首建鼠，均可传代。

图2 Lrp2bp在1月龄野生小鼠不同组织中的表达Fig.2 The expression of Lrp2bp gene in different tissues of wild type mice aged 1 month

图3 αMHC－Lrp2bp表达载体的构建Fig.3 The construction of αMHC－Lrp2bp vector

2.5 L rp2bp基因在转基因小鼠心脏中的表达

提取4个首建鼠一月龄F1代转基因小鼠和同窝阴性小鼠心脏组织总蛋白，用Western blotting分析Lrp2bp基因的表达。结果显示，Lrp2bp基因在1、3和6三个转基因品系的心脏组织中高表达(图5)。

注:P:以转基因质粒为模板的阳性对照;N:阴性对照;H2O:空白对照;M:DL2000 DNA分子量标记;1～7:为转基因鼠的DNA样品。图4转基因小鼠的PCR鉴定Note:P is αMHC－Lrp2bp p lasmid used as positive control;N is the negative control;H2O is water as the blank control;M is DL2000 DNA marker;1－7 are genomic DNA samples from the transgenic mice.Fig.4 Genotyping of the transgenic mice by PCR

2.6 超声检查

注:WT是野生型对照，Tg 1、Tg 3、Tg 6和Tg 7是4个转基因阳性品系。图5 Lrp2bp基因在首建鼠F1代小鼠心脏中的表达Note:WT is wild type mice control;Tg 1，3，6 and 7 a re the trangenic lines.Fig.5 The expression of Lrp2bp gene in the heart of transgenic mice

1、3月龄Lrp2bp转基因小鼠和同窝阴性小鼠进行心脏超声影像分析(表1)，结果显示，1月龄Lrp2bp转基因小鼠收缩期和舒张期左室前壁厚度(LVAW)分别增加20%和14%。收缩期左室内径(LVID，systolic)增加16%，舒张期左室内径(LVID，diastolic)增加9%，射血分数(EF%)和短轴缩短率(FS%)分别降低8%和10%;3月龄转基因小鼠心脏收缩期左室前壁厚度增加16%，舒张期左室前壁厚度增加22%，其他监测指标与野生对照小鼠相比无显著差异。

上述数据表明，Lrp2bp转基因小鼠出生后即心腔扩大，心壁变厚，心功能下降，但是随月龄增长，病理表型逐渐消失。表明Lrp2bp基因表达对心脏发育及心肌病发生发展起到一定的调节作用。

表1 1、3月龄Lrp2bp和野生型小鼠M超声参数的独立样本t检验(±s)Tab.1 Independent samples T test of wild type and Lrp2bp transgenic mice aged 1 and 3 months(±s)

表1 1、3月龄Lrp2bp和野生型小鼠M超声参数的独立样本t检验(±s)Tab.1 Independent samples T test of wild type and Lrp2bp transgenic mice aged 1 and 3 months(±s)

注:*P＜0.05，**P＜0.01;野生型，n=16;Lrp2bp转基因，n=18.Note:*P＜0.05，**P＜0.01;W ild type，n=16;Lrp2bp tg mice，n=18.

年龄(月) Age (month)组别Group收缩期左室前壁LVAW，s (mm)舒张期左室前壁LVAW，d (mm)收缩末期左室内径LVESD (mm)舒张末期左室内径LVEDD (mm)射血分数(%) EF (%)短轴内径缩短率(%) FS(%) 1月龄One month野生型Wild type 1.02±0.1 0.63±0.1 1.93±0.3 3.25±0.2 76.17±5.1 44.10±4.9转基因Lrp2bp tg 1.23±0.1**0.77±0.1**2.24±0.3**3.54±0.2**70.06±7.8*39.27±6.3*3月龄Three months野生型W ild type 1.05±0.1 0.68±0.06 2.65±0.3 3.84±0.3 62.46±6.2 33.38±4.5转基因Lrp2bp tg 1.25±0.3*0.83±0.10*2.65±0.6 3.84±0.3 64.26±14.1 35.63±10.9

2.7 电镜超微结构

6月龄小鼠心脏的透射电镜显示，野生小鼠的心肌纤维排列规则，结构清晰;而Lrp2bp转基因小鼠的心肌纤维肌小节变长，Z带变窄，肌浆网轻度扩张(图6)。

注:A，野生鼠;B，Lrp2bp转基因鼠。肌小节长度(双向箭头)，肌浆网(箭头)，线粒体(白色星星)。图6 6月龄小鼠左心室电镜图Note:A:W ild type mice.B:Lrp2bp tg mice.The double headed arrow indicates sarcomere length.The arrowhead indicates sarcoplasmic reticulum.The white star indicates mitochondria.Fig.6 Respresentative transmission electron micrographs of the cardiomyocytes in the left ventricle wall from mice aged 6 months

3 讨论

低密度脂蛋白受体相关蛋白2(LDL receptorrelated protein 2，Lrp2)是近年来发现的一种细胞表面蛋白，属于一种内吞性受体，是低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)基因家族七大成员之一。Lrp2除了参与内吞作用外，还具有细胞信号传导功能。Lrp2bp作为与Lrp2结合的一种新型接头分子，可能通过与受体相互作用，招募各种蛋白分子形成蛋白复合体，介导受体参与信号转导。酵母双杂交实验揭示，与Lrp2bp结合的蛋白分子可以分为两大类:转录调节子如ski作用蛋白(SKI－interacting protein)和信号转导成分包括蛋白激酶Cα结合蛋白(PRKCABP)和促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)等。然而，Lrp2和Lrp2bp相互作用的分子机制及参与的具体生理过程还有待于阐明［1］。

人低密度脂蛋白受体相关蛋白2结合蛋白在各种组织和器官中广泛表达，在人子宫、睾丸、小肠、结肠、血液白细胞及人胰腺癌细胞系中表达水平较高［8，9］。本研究中Lrp2bp基因小鼠组织表达谱显示，Lrp2bp主要在成年小鼠肾脏中表达，在心脏中也有少量表达。mRNA水平上，Lrp2bp在扩张型心肌病模型小鼠心脏中表达较高，提示Lrp2bp在心脏发育及心肌病发生发展中起到重要作用。

目前关于Lrp2bp基因功能的研究较少，更没有和心肌病之间联系的相关报道。本研究建立的Lrp2bp转基因小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比发生了显著变化，表明Lrp2bp基因的表达可能在心肌病发生发展中起到一定的调节作用。由于机体自身的代偿作用，使这种表型随月龄增长而逐渐消失，因此我们将用Lrp2bp转基因小鼠与转基因扩张型心肌病和肥厚型心肌病小鼠杂交，进一步研究Lrp2bp在心肌病发病中的作用，为心肌病的机制研究和治疗提供线索。

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Com pensation Effect of L rp2bp on the Heart Function in the Heart Tissue Specific Transgenic M ice

ZHANG Li，QUAN Xiong－zhi，DONG Wei，WANG Shu－mei，ZHANG Xiao－juan，GE Wen－ping，GAO Shan，ZHANG Lian－feng*
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，and Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo generate heart tissue specific Lrp2bp transgenic mouse and to study its effects on cardiomyopathy.M ethods The transgenic plasmid was constructed by inserting the murine Lrp2bp gene into the downstream of α－MHC promoter.The transgenic mice were created by microinjection.The genotype of transgenic line was identified by PCR and the expression level of the gene was determined by Western blotting.The cardiac function and geometry were detected by echocardiography.The ultrastructural changes of cardiomyocytes from Lrp2bp transgenic mice were observed by transmission electron microscopy.Results Three lines of C57BL/6J transgenic mice with high level of Lrp2bp expression were identified from four transgenic founders.At 1 month old，the Lrp2bp transgenic mice showed increased thickness of the ventricular wall，dilated ventricular chamber，decreased ejection fraction and decreased fractional shortening compared with that of wild type mice.ConlusionTransgenic mice with cardiac tissue specific Lrp2bp gene have been established successfully and Lrp2bp caused compensation effect on the cardiomyopathy in the transgenic mice.

Lrp2bp;Transgenic mouse;Heart;Compensation

R349.6

A

1005－4847(2010)02－0131－05

2009－12－17

卫生部项目，实验动物和人类疾病动物模型资源扩展(200802036)和十一五新药专项支持(2009ZX09501－026)。

张丽，女，博士研究生，E－mail:zhangliqq2004@126.com

张连峰，Tel:86－010－87778442;E－mail:Zhanglf@cnilas.org