蒽酮-硫酸法和3,5-二硝基水杨酸法测定杜仲水提液多糖含量

李 强，唐 微，石园园，李嘉惠，李艳红，刘 悦（郧阳医学院，湖北十堰442000）

蒽酮-硫酸法和3,5-二硝基水杨酸法测定杜仲水提液多糖含量

李 强，唐 微，石园园，李嘉惠，李艳红，刘 悦（郧阳医学院，湖北十堰442000）

采用蒽酮-硫酸法测定杜仲水提液中总糖含量，3，5-二硝基水杨酸法测定杜仲水提液中单糖含量，多糖含量为总糖与还原糖含量之差。该法简便、快速、准确、稳定，为其他材料水提液中多糖定量提供参考。

蒽酮-硫酸法，3，5-二硝基水杨酸法，杜仲，水提液，多糖

Abstract：The concentration of total sugar in water extraction from Eucommia ulmoides Oliver was determined by anthrone-sulfuric method，while the concentration of reducing sugar was determined by DNS method，however the concentration of polysaccharide depended on their concentration difference.The results showed that the methods were convenient，rapid，accurate and stable.It provided some references for determination of polysaccharide in water extraction from the other meterials.

Key words：anthrone-sulfuric method；3，5-dinitrosalicylic acid method；Eucommia ulmoides Oliver；water extraction；polysaccharide

多糖是由多个单糖分子脱水、缩合所组成的高分子化合物，广泛分布于动物、植物和微生物中，是构成生命活动的四大基本物质之一，具有抗肿瘤、增强免疫、抗炎症、抗病毒、抗凝血、降血糖、抗衰老等作用［1］。近年来，多糖已成为保健食品和医药行业关注的热点。多糖提取工艺的优化是多糖产品研究与开发的重要环节。多糖提取工艺有溶剂浸提法、酶法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法等［2］。对多糖提取工艺进行研究时，需要对不同工艺条件下水提液多糖含量进行测定，以多糖得率为指标确定最优提取工艺。为避免单糖影响多糖得率，一般对水提液进行醇沉，溶解后进行多糖定量。若直接对水提液进行多糖测定可简化实验流程。受原材料处理、溶液pH、水提温度等因素影响，水提液中可能存在单糖干扰，采用蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法只能测定总糖含量。3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）［3］可测定多糖水提液的总糖和还原糖，多糖含量以总糖和还原糖之差表示，能去除单糖干扰，但制备总糖试液需浓HCl水解样品，较费时，繁琐，且浪费样品。本实验以杜仲为原料，采用蒽酮-硫酸法和DNS法分别测定杜仲水提液中总糖和还原糖含量，以总糖和还原糖之差表示多糖含量，并进行方法学考察。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杜仲 购于十堰市中药材公司，产地湖北；葡萄糖 上海化学试剂分装厂；蒽酮 上海试剂一厂；3，5-二硝基水杨酸 湖州市菱湖望菱试剂厂；其他试剂 为国产分析纯。

MP120-2型电子天平 上海良平仪器仪表有限公司；HH·SY11-Ni型电热恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司；722S型可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 葡萄糖标准溶液的配制 精确称取烘干至恒重的葡萄糖0.100g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，得浓度为100mg/L的葡萄糖标准溶液，如法配制浓度为1000mg/L的葡萄糖标准溶液。

1.2.2 蒽酮试剂的配制 精确称取蒽酮2.000g，用98%浓硫酸溶解并定容至1000mL。

1.2.3 DNS试剂的配制 精确称取6.5g 3，5-二硝基水杨酸溶于少量热水，移入1000mL容量瓶，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入丙三醇45g，摇匀，定容至1000mL。

1.3 实验方法

1.3.1 杜仲水提液的制备 杜仲烘干，粉碎，过40目筛，加入15倍85%乙醇，82℃回流脱脂2h，真空抽滤并用85%乙醇冲洗6次，烘干备用。精确称取备用杜仲粉40g，加入15倍水，90℃提取2h得到杜仲水提液。

1.3.2 总糖和还原糖供试液的制备 取一定量杜仲水提液准确稀释30倍，稀释液作为总糖供试液。未稀释杜仲水提液作为还原糖供试液。

1.3.3 总糖标准曲线的制作 采用蒽酮-硫酸法［4］。精确量取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 葡萄糖标准液（100mg/L）于6支试管中，再分别加入蒸馏水至总体积为1mL，摇匀后分别加入5mL蒽酮试剂，混匀后置于沸水浴中加热6min，取出冷却至室温，以空白管为对照，在620nm波长处测定吸光度。以吸光度为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 还原糖标准曲线的制作 采用DNS法［5］。分别精密吸取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 葡萄糖标准液（1000mg/L），加入8个25mL容量瓶中，加水至总体积为2.5mL，再分别加入3mL DNS试剂，混匀后置于沸水浴中加热5min，取出后立即冷却至室温，加水定容至25mL，摇匀后，以空白管为对照，在540nm处测定吸光度。以吸光度为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.5 多糖含量计算 多糖含量=总糖含量-还原糖含量

1.3.6 精密度实验 取总糖和还原糖供试液6份各1mL，分别按1.3.3项和1.3.4项下方法操作，测定吸光度，考察蒽酮-硫酸法和DNS法的精密度。

1.3.7 稳定性实验 取总糖供试液1mL，按1.3.3项下方法操作，在 0、10、20、30、60、90min 测定吸光度，考察蒽酮-硫酸法稳定性。取还原糖供试液1mL，按1.3.4 项下方法操作，在0、10、20、30、40、50、60、90min测定吸光度，考察DNS法稳定性。

1.3.8 加样回收率实验 精密吸取总糖含量为53.72mg/L的杜仲水提液6份各0.5mL，各精密加入100mg/L标准葡萄糖液0.5 mL，按1.3.3项下方法操作，测定吸光度并计算蒽酮-硫酸法回收率。精密吸取还原糖浓度为596.40mg/L的杜仲水提液6份各0.6mL，各精密加入1000mg/L标准葡萄糖液0.6mL，按1.3.4项下方法操作，测定吸光度并计算DNS法回收率。

1.3.9 杜仲水提液多糖含量测定 取6份杜仲水提液，按1.3.3项和1.3.4项下方法操作，测定吸光度代入相应标准曲线回归方程，以1.3.5项下方法计算水提液多糖含量。

2 结果与分析

2.1 总糖标准曲线

总糖标准曲线见图1，线性回归方程为：y=192.56x-0.3867，R2=0.9999，说明葡萄糖浓度在20～100mg/L范围内线性良好。

2.2 还原糖标准曲线

还原糖标准曲线见图2，线性回归方程为：y=4326.2x+101.01，R2=0.9997，说明葡萄糖浓度在200～1400mg/L范围内线性良好。

图1 总糖标准曲线

图2 还原糖标准曲线

2.3 精密度实验

结果见表1和表2，表明蒽酮-硫酸法测定总糖和DNS法测定还原糖精密度良好。

表1 蒽酮-硫酸法测定总糖精密度实验结果

表2 DNS法测定还原糖精密度实验结果

2.4 稳定性实验

结果见表3和表4，表明蒽酮-硫酸法测定总糖显色在90min内较稳定，DNS法测定还原糖显色在30min内较稳定。

表3 蒽酮-硫酸法测定总糖稳定性实验结果

表4 DNS法测定还原糖稳定性实验结果

2.5 加样回收率实验

结果见表5和表6，表明蒽酮-硫酸法测定总糖和DNS法测定还原糖加样回收率较好。

表5 蒽酮-硫酸法测定总糖加样回收率实验结果

表6 DNS法测定还原糖加样回收率实验结果

表7 杜仲水提液多糖含量测定实验结果

2.6 杜仲水提液多糖含量测定

结果见表7，表明采用蒽酮-硫酸法和DNS法测定杜仲水提液中多糖结果稳定、可靠。

3 结论

杜仲经乙醇回流预处理，水提液中仍有大量单糖，本实验用蒽酮-硫酸法和DNS法分别测定水提液中总糖和还原糖含量，多糖含量为总糖与还原糖含量差值，排除了单糖干扰，测得准确的多糖含量。此法简便、快速、准确、稳定，适于杜仲水提液多糖定量，为其他材料水提液多糖定量提供参考。

［1］丁保金，金丽琴，吕建新.多糖的生物活性研究进展［J］.中国药学杂志，2004，39（8）：561-564.

［2］尹艳，高文宏，于淑娟，等.多糖提取技术的研究进展［J］.食品工业科技，2007，28（2）：248-250.

［3］李卫彬，阳文辉，黄锁义，等.当归总糖、还原糖和多糖的含量测定方法探讨［J］.微量元素与健康研究，2008，25（3）：46-47.

［4］王宪泽.生物化学实验技术原理和方法［M］.北京：中国农业出版社，2002：52-54.

［5］宋俊英.茶薪菇总糖、还原糖和多糖的测定［J］.中草药，2006，37（9）：1421-1422.

Determination of polysaccharide in water extraction from Eucommia u/moides Oliver by 3，5-dinitrosalicylic acid（DNS）method and anthrone-sulfuric method

LI Qiang，TANG Wei，SHI Yuan-yuan，LI Jia-hui，LI Yan-hong，LIU Yue
（Yunyang Medical College，Shiyan 442000，China）

TS207.3

A

1002-0306（2010）10-0370-03

2009-11-10

李强（1979-），男，硕士，讲师，主要从事生物活性成分研究。基金项目：郧阳医学院科研基金资助项目（2006QDJ06）。