一种具有抗脂肪肝作用的脂肪酶的实验研究

肖友元,何宇新,李 玲,谢 雷

1四川省人民医院,成都 610072;2西华大学生物工程学院,成都 610039;3成都自豪药业有限公司,成都 610041

一种具有抗脂肪肝作用的脂肪酶的实验研究

肖友元1,何宇新2＊,李 玲2,谢 雷3

1四川省人民医院,成都 610072;2西华大学生物工程学院,成都 610039;3成都自豪药业有限公司,成都 610041

为了研究特种脂肪酶 ZFM对大鼠非酒精单纯性脂肪肝 NAFLD的防治作用,本次实验通过给大鼠NAFLD模型灌胃 ZFM,然后进行常规观察、体重及肝脏器系数测定、血清中ALT和AST的含量动态测定、肝脏肉眼大体外观变化情况观察、肝组织内 TG的含量测定、肝组织病理学分析等。结果表明,ZFM显著降低ALT活性及肝组织 TG含量,同时也可减轻肝脂肪变性的程度,说明 ZFM具有显著的抗大鼠NAFLD的作用。

特种脂肪酶;非酒精性脂肪肝;甘油三酯;谷丙转氨酶;谷草转氨酶

非酒精单纯性脂肪肝 (Non-alcohol fatty liver disease,NAFLD)是由于各种肝内外因素所致的肝脏脂肪代谢功能障碍,导致肝细胞内脂类物质 (主要为三酰甘油)蓄积过多和变性的病理综合征,包括单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎和肝硬化[1]。当肝细胞受到损伤时,谷丙转氨酶 (Alanine aminotransferase,ALT)释放到血液中,血清中 ALT的活力随之升高,1%的肝脏受损,可以使血清中ALT的浓度增加 1倍。正常情况下,血清中的谷草转氨酶 (Aspartate aminotransferase,AST)的活力不高,但当组织细胞,特别是肝脏和心脏等器官的细胞发生病变时,会导致血清中 AST的活力明显升高[2]。所以,ALT和AST可以比较敏感地监测到肝脏是否受到损害。本试验通过高脂乳液灌胃大鼠,造成大鼠非酒精单纯性脂肪肝模型,考查特种脂肪酶(ZFM)对大鼠NAFLD的防治作用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

SD大鼠,体重 230～250 g,雌雄各半(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供),合格证号SCXK(京)2007-0001;特种脂肪酶(ZFM)受试药(由成都自豪药业有限公司提供,批号:081223),实验时先用适量吐温研磨,再用 0.5%的羧甲基纤维素钠(CMC)按设计浓度配制;易善复 (多烯磷脂酰胆碱胶囊)(塞诺菲安万特 (北京)制药有限公司,批号:D8139),实验时先用适量吐温研磨,再用 0.5%的羧甲基纤维素钠(CMC)按设计浓度配制。

1.2 试剂

胆固醇 (成都科龙化工试剂厂,批号: 20071229);吐温-80(成都科龙化工试剂厂,批号: 20050402);胆酸钠 (上海 Solarbio,批号:20060826);丙硫氧嘧啶片(上海复星朝晖药业有限公司,批号: 071105);1,2丙二醇 (天津市大茂化学试剂厂,批号:20051128);羧甲基纤维素钠 (上海三浦化工有限公司,批号:20010911)。

1.3 仪器

LD2-5医用离心机(北京医用离心机厂);SHAC恒温振荡器(常州国化电器有限公司);T MS-1024i全自动生化分析仪 (日本国东京医疗公司);BP221型电子天平(SARTOR IOU)。

1.4 实验分组与方法

取 SD大鼠,体重 230～250 g,64只,雌雄各半,随机分为 4组,每组动物 16只。将大鼠适应性饲养3 d后,每天上午各组大鼠分别按表 1设计剂量给药,空白组给予相应的 CMC混悬液;下午除空白组外,其余各组大鼠分别灌胃给予高脂乳液 (20%猪油、8%胆固醇、1.2%胆酸钠和 0.6%丙硫氧嘧啶) lmL/l00 g。于第 4周后末次给药后禁食 16 h(不禁水),眼眶取血,离心并分离血清,动态测定给药 4周后的血清生化指标。

于第 6周后末次给药后禁食 16 h(不禁水),称取大鼠体重,股动脉取血,离心并分离血清,-30℃低温保存,待测血清中的生化指标;另摘取肝脏并称重,观察大体外观后,每只大鼠在相同部位切下 2 g肝组织置于预冷的生理盐水中制成 1O%肝匀浆,4℃静置 48 h后,10000 r/min,离心 20 min,取上清液,用全自动生化仪测定肝组织内甘油三酯 (Triglyceride,TG)的含量;另取肝左叶 1块放于 10%中性福尔马林溶液,待作肝组织病理学检查 (固定后,石蜡包埋,切片作 HE染色)。

1.5 统计方法

用 SPSS11.5统计软件进行统计分析。以(x±s)表示结果的数据,用单因数方差分析进行组间比较,肝病理组间差异的显著性检验运用非参数检验Ridit分析方法,显著性水平为P＜0.05,及显著水平为P＜0.01。

目前，B公司对经销商的培训严重不足，导致经销商无法学习到业内优秀经验，无法吸取行业内经验教训，无法获取公司最新的经营理念和行业前沿信息，影响经销商管理效果。

2 结果

2.1 常规观察

实验期间空白组动物活动、饮食正常、皮毛光亮整洁、体重持续增长,其余各组在灌胃给予高脂乳液两周后逐渐出现不同程度的精神萎靡、活动减少、体重增加缓慢、无力、蜷缩、饮食减少、皮毛凌乱、萎黄等。

2.2 体重及肝脏器系数测定

结果提示,灌胃给予高脂乳液一定周期后,模型对照组体重增加缓慢,和空白对照组比较有显著性差异(P＜0.01),ZFM剂量组和易善福组在给药前4周均有抵抗大鼠体重增加缓慢的作用趋势,但无统计学意义。

另脂肪肝模型大鼠的肝脏指数较空白组明显升高(P＜0.01);ZFM剂量组和易善福组均有降低脂肪肝模型大鼠的肝脏器系数的作用趋势,但无统计学意义。结果见表 2

表 2 ZFM对脂肪肝大鼠体重及肝脏器系数的影响(x±s)Table 2 The effects of the weight of fatty liver and coefficient by ZFM(x±s)

2.3 血清中ALT﹑AST的含量动态测定

血清中ALT﹑AST的含量动态测定结果见表3。

表 3 ZFM对大鼠脂肪肝血清中ALT﹑AST的含量的影响(x±s)Table 3 The effects ofALT﹑ AST in serum of the fatty liver by ZFM(x±s)

当急性肝炎和慢性肝炎和轻型,虽有肝细胞的损伤,肝细胞的线粒体仍保持完整,故释放入血的只有存在于肝细胞浆内的 ALT,故 ALT升高明显;重型肝炎和慢性肝炎的中型和重型,肝细胞的线粒体也遭到了严重的破坏,AST从线粒体和胞浆内释出, AST也明显升高。结果提示,在给予高脂乳液 4周, 6周后,脂肪肝模型大鼠血清中ALT的活性明显较空白组明显升高 (＊＊P＜0.01);与模型对照组相比,ZFM剂量组及易善复组均能明显降低模型大鼠ALT活性 (＊P＜0.05),表明 ZFM具有一定的降酶作用。

但脂肪肝模型大鼠血清中AST未明显升高,原因可能为我们通过高脂乳液造成的非酒精性脂肪肝模型,该模型程度较轻,肝细胞的线粒体未遭到严重的破坏。

2.4 肝脏肉眼大体外观变化情况

空白组肝脏肉眼观察呈鲜红色,边缘锐利,表面光滑。脂肪肝模型对照组肉眼见肝脏体积增大,边缘变钝,颜色呈奶黄色,切面油腻状,有明显脂肪颗粒,提示病变基础是肝细胞脂肪积聚;ZFM给药组和易善复组肝脏肉眼观察有部分肝脏呈鲜红色。

2.5 肝组织内甘油三酯的含量结果见表 4

表 4 ZFM对脂肪肝大鼠肝组织内 TG的影响(x±s)Table 4 The effects of the TG in fatty liver by ZFM(x±s)

注:和模型组比较,＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。

Tagging:Comparison to the model group,＊P＜0.05,＊＊P＜0.01.

脂肪肝主要是 GT大量堆积于肝脏所致的一种病理改变,因此测定肝组织中 GT的含量尤为重要,结果提示,非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞内 GT含量明显升高,与空白组比较,差异有高度显著性 (＊＊P＜0.01),ZF M剂量组及易善复组,均能显著降低大鼠肝组织 GT的含量(＊P＜0.05),表明 ZF M具有一定的降低大鼠肝脂肪变性的作用。

2.6 肝组织病理学分析(HE染色,100×)

表 5 肝组织病理损伤判断标准Table 5 The yardstick of pathological injury of liver

脂肪空泡融合为大空泡,将细胞核挤向胞膜下,状似脂肪细胞。 重度损伤 +++ 3坏死Necrosis 表示没有坏死, 无 0点状坏死,肝小叶内可有散在的肝细胞坏死,每个坏死灶仅累及单个或几个肝细胞。 轻度损伤 + 1碎小片状坏死,肝细胞呈灶状坏死,崩解 中度损伤 ++ 2有大片溶解灶性坏死。 重度损伤 +++ 3纤维化 没有增生 无 0组织增生 Fibrosis tissue 仅有纤维细胞及少许纤维组织增生,正常肝小叶结构隐约可见。 轻度损伤 + 1有明显的纤维组织增生,正常肝小叶结构不明显,但尚未形成明显假小叶。中度损伤 ++ 2有大量组织增生,将细胞围成小块呈小岛状,明显假小叶形成。 重度损伤 +++ 3

表 6 肝病理分级结果(表中数为例数)Table 6 Pathological of liver and results(the number is examples)

表 7 ZFM对脂肪肝大鼠肝脏病理的影响Table 7 The effects of liver pathology of the fatty liver by ZFM

图 1 ZFM对脂肪肝大鼠肝脏病理的影响Fig.1 The effects of liver pathology of the fatty liver by ZFM

由表 6、表 7、图 1可知,模型组与空白对照组比较,出现了肝细胞的脂肪变性,经非参数检验,具有极显著性差异 (＊＊P＜0.01),表明造模成功;与模型组比较,ZFM剂量组及易善复组均可显著降低肝脂肪变性程度 (＊P＜0.05),表明 ZFM具有一定的降低脂肪肝大鼠脂肪变性的作用。

但从表 6可知,其中 ZFM剂量组肝坏死评定中,有一只大鼠肝脏病理评分为坏死 2分,经仔细核查,排除原发性可能,虽然动物实验数据具有一定的动态波动,也属正常,同时因供样量太少,仅有一个剂量,但对于一个抗脂肪肝的新药来说,以后的研究中,须严密考查该试验药长期给药后,在减轻脂肪变性的同时,是否也会引起肝细胞的损伤。

3 结论

脂肪肝 (Fatty Liver)作为一种病理学概念,系指肝内脂肪含量超过肝湿重的 5%,或肝活检 1/3以上肝细胞有脂肪变性且弥漫分布于全肝。其对应的临床概念是脂肪性肝病 (Fatty Liver Disease,FLD),系指病变主体在肝小叶,以弥漫性肝细胞脂肪变(多为大泡性脂肪变)为病理特征的临床综合征。目前,按相关专业委员会的疾病诊断标准及有关共识可以明确的是:①脂肪性肝病在临床上根据患者有无过量饮酒史,分酒精性脂肪性肝病 (酒精性脂肪肝)和非酒精性脂肪性肝病;②酒精性肝病临床诊断通常分为轻症酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化;③非酒精性脂肪性肝病一般在病理上分为单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎 (NASH)和肝硬化三种类型。

本次实验研究旨在通过高脂乳液灌胃大鼠,造成大鼠非酒精单纯性脂肪肝模型,考查该试验药对大鼠非酒精单纯性脂肪肝的防治作用,实验结果表明,模型对照组与空白对照组比较,肝脏器系数﹑ALT活性、肝组织甘油三酯含量均显著升高,同时肝病理也显示出现了一定的脂肪变性,按照专业委员会的诊断标准,该模型属于非酒精单纯性脂肪肝模型;ZFM剂量组和模型对照组比较,可显著降低ALT活性及肝组织甘油三酯含量,同时也可减轻肝脂肪变性的程度。

综上所述:通过微生物发酵得到的 ZFM试验药,具有显著的抗非酒精单纯性大鼠脂肪肝的作用,具有创新药物开发前景。同时,对于一个抗脂肪肝的新药来说,以后的研究再观察对酒精性脂肪肝的作用做系统的研究,再严密考查该试验药长期给药后,在减轻脂肪变性的同时,进一步探讨其作用机理。

1 Guo LL(郭丽丽),Liu JC(刘近春).The observation of curative efects of polyene phosphatidyl choline in combination with compound salvial injection for nonalcoholic fatty liver disease.J ChangzhiM ed Coll(长治医学院学报),2009,2: 117-119.

2 Zhou X(周新),Xu ZG(徐植光).ClinicalBiochemistry and Biochemistry Test(临床生物化学与生物化学检验).Beijing:People's Health Publishing House,2003.238-239.

Anti-fatty L iver Effect of a kind of L ipase

XIAO You-yuan1,HE Yu-xin2＊,L ILing2,XIE Lei3

1The People’s Hospital of Sichuan Province,Chengdu 610072,China;2B io-Engineering College of Xihua University, Chengdu 610039,China;3Chengdu Zihao pha rm aceutical Co.,Ltd.Chengdu 610041,China

To research the preventive and therapeutic effects of ZFM for non-alcohol fatty liver disease(NAFLD),in this experimentwe used ZFM to gavage to the NAFLD model.Investigate the generalobservation,theweightof fatty liver and coefficient,dynamic measurement ofALT and AST,observe the gross appearance by naked eye,measure the TG,analyse the yardstick of pathologicalof liver.The results showed that,ZFM can extraordinary reduce the activity ofALT and TG, and ease liver degeneration.Thus it could be concluded ZFM has extraordinary activity forNAFLD.

ZFM;NAFLD;TG;ALT;AST

R575

A

1001-6880(2010)05-0781-05

2009-09-21 接受日期:2010-04-27

＊通讯作者 Tel:86-28-87725898;E-mail:heyuxin66@126.com