剑麻提取物的细胞毒活性研究

胡力飞,梅文莉,易克贤,戴好富

中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室,海口 571101

剑麻提取物的细胞毒活性研究

胡力飞,梅文莉,易克贤,戴好富＊

中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室,海口 571101

用溶剂萃取法对剑麻的 95%乙醇提取物进行分段处理,利用MTT法测定各提取部位的体外细胞毒活性。正丁醇提取物对肿瘤细胞株 K-562、S MMC-7721和 SGC-7901显示有生长抑制活性,IC50值分别为 5.6、23.8和 26.8μg/mL,而石油醚、乙酸乙酯和水溶性部位则没有活性。

剑麻;细胞毒活性;MTT法

剑麻 (Agave sisalanaPerrine)又名菠萝花,为龙舌兰科龙舌兰属植物,是亚热带特有的多年生草本经济作物。原产墨西哥尤卡坦半岛,我国海南、广东、广西、云南和福建等省均有种植。剑麻叶具有凉血止血、消肿止痛之功效,民间常用于治疗肺痨咯血、衄血、便血、痢疾、痈疮肿毒和痔疮[1]。剑麻叶片含丰富的纤维,是重要的工业原料,在剑麻叶片抽取纤维后的叶汁中含有有甾体骨架的剑麻皂苷元(Tigogenin),是合成甾体激素类药物的重要原料[2]。本实验利用溶剂法对剑麻的乙醇提取物进行分段处理,并运用MTT法,选择人慢性髓原白血病细胞株 K-562、人肝癌细胞株 S MMC-7721和人胃腺癌细胞株 SGC-7901为实验细胞株,研究剑麻提取物对肿瘤细胞的体外增殖作用和剂量效应关系,为剑麻资源的进一步开发利用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

试验用植物样品采自广东湛江,由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所王祝年研究员鉴定为剑麻 (Agave sisalanaPerrine),凭证标本(20080701),现存于中国热带农业科学院。

四甲基偶氮唑盐 (MTT)、MEM和平衡盐溶液PBS(北京欣经科公司);丝裂霉素 C(kyowa Hakko kogyo Co.Ltd.)。CO2培养箱 (RSBiotech Ltd.);酶标仪 (BioTek Instruments,Inc.)。

人慢性髓原白血病细胞株 K-562、人肝癌细胞株 S MMC-7721和人胃腺癌细胞株 SGC-7901购自中国科学院细胞库,在含有 10%小牛血清的 RPM I1640培养基中,于 5%CO2、湿度 90%以上、37℃温箱中培养,贴壁细胞用 0.25%胰酶消化。

1.2 样品的制备

取新鲜剑麻叶片 (10.5 kg),粉碎后用重蒸的95%工业乙醇冷浸提取 3次,提取液浓缩至无醇味后分散于水中,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别得到石油醚提取物 (Pet),乙酸乙酯提取物(E tOAc)、正丁醇提取物 (n-BuOH)和水提物 (H2O)。上述4种提取物均用于体外抗肿瘤活性筛选。

1.3 体外肿瘤细胞生长抑制实验 (MTT法)[3]

实验设阴性对照组 (DMSO溶剂对照组)、阳性对照组 (丝裂霉素C)和 5个不同浓度的待测样品,每个浓度设 2个平行。

收集对数生长期细胞,血球计数板计数,按每孔4500个癌细胞量接种于 96孔平底细胞培养板中,置于 5%CO2、湿度 90%以上、37℃温箱中培养。24 h后取出加入一定量的待测样品,继续培养 3 d后取出置于显微镜下观察每孔细胞形态,记录细胞形态变化情况,接着每孔加入5 mg/mL的MTT溶液(溶于平衡盐溶液 PBS)50μL,37℃反应 4 h后,将细胞培养液吸出,每孔加入 100μL DMSO使For mazane充分溶解后,将细胞培养板置于 ELX-800酶标仪上,用 490 nm波长测各孔的吸光度 (A),按下列公式求生长抑制率。而后以样品浓度为横坐标,以抑制率为纵坐标,作图并求出抑制率为 50%时样品的浓度 (I C50),样品活性结果即以半数抑制浓度 (IC50)表示。

2 结果与讨论

以MTT法对剑麻的 4种提取物进行了体外肿瘤细胞毒活性筛选,结果见图 1和表 1。从图表中可以看出,石油醚提取物 (Pet),乙酸乙酯提取物(EtOAc)和水提物 (H2O)的筛选结果均为阴性;而正丁醇提取物 (n-BuOH)对体外培养的人慢性髓原性白血病细胞株 K-562、肝癌细胞株 S MMC-7721和胃癌细胞株 SGC-7901的增殖均显示出抑制作用,在测定浓度范围内呈现良好剂量依赖性,对人慢性髓原性白血病细胞株 K-562、肝癌细胞株S MMC-7721和胃癌细胞株 SGC-7901的 I C50值分别为 5.6μg/mL、23.8μg/mL和 26.8μg/mL。

图 1 剑麻 n-BuOH提取物对肿瘤细胞的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of the n-BuOH extract fromA-gave sisalanaon tumer cell lines

表 1 剑麻提取物的 IC50值 (μg/mL)Table 1 The IC50values of extracts fromAgave sisalana(μg/ mL)

剑麻乙醇提取物的正丁醇部位的化学成分主要为高极性成分。据文献报道,龙舌兰属植物中含大量的甾体皂苷元和甾体皂苷[4]。杨崇仁等从剑麻叶汁提取物的甲醇部分中分离得到 5个甾体皂苷dongnoside A、B、C、D、E[5,6],每个甾体皂苷的糖链含有 5个糖单位以上,糖链由葡萄糖,木糖,半乳糖和鼠李糖 4种单糖组成。剑麻中的抗肿瘤活性成分是否就是这些甾体皂苷,还有待进一步研究确证。

此外,我们通过薄层层析 (TLC)比较了剑麻及抽取纤维后麻渣的乙醇提取物的正丁醇部位的化学成分,发现二者所含化学成分基本一致。目前在广东湛江地区,抽取纤维后的麻渣均为废弃物,既浪费了资源,又污染了环境。因此本次研究结果将为剑麻麻渣的开发利用提供科学依据。

1 Editorial Committee of Chinese Materia Medica.State Drug Administration of China.Chinese Materia Medica(中华本草).Shanghai:Science and Techonology Press,1999.7244.

2 Han YL(韩耀玲),Lin CW(林翠梧).Extraction and isolation of tigogenin.J Henan univ,M ed Sci(河南大学学报,医学版),2006,25:27-29.

3 Mos mann T.Rapid color imetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Imm unolM ethods,1983,65:55-63.

4 Zhang YH(张援虎),Wang FP(王锋鹏).Recent Advance of Chemical Constituents ofAgave SPP.Plants.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发),2003,15:349-353.

5 Ding Y,Tian RH,YangCR,et al.Two new steroidal saponins from dried fermented residuesof leaf-juices ofAgave sisalanaforma dongNo.1.Chem Phar m Bull,1993,41:557-560.

6 Ding Y,Chen YY,WangDZ,et al.Steroidal saponins from a cultivated form ofAgave sisalana.Phytochem istry,1989,28: 2787-2791.

Cytotoxic Activity ofAgave sisalanaExtract

HU Li-fei,MEIWen-li,YI Ke-xian,DA IHao-fu＊
Key Laboratory of Tropical Crop B iotechnology,M inistry of Agriculture,Institute of Tropical B ioscience and B iotechnology,Chinese Academ y of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101,China

The 95%ethnol extract fromAgave sisalanawas treated by solvent partition to afford different extracts.The cytotoxic activities of the different extractsin vitrowere evaluated byMTTmethod.Then-butanol extract showed inhibitory effect on the cell linesof K-562,S MMC-7721 and SGC-7901 with the I C50valuesof 5.6,23.8 and 26.8μg/mL,respectively.The extract of petroleum ether,ethyl acetate and water-soluble showed no activity.

Agave sisalanaPerrine;cytotoxic activity;MTTmethod

R284.2;R285

A

1001-6880(2010)05-0907-02

2009-08-13 接受日期:2009-11-03

973计划前期研究专项 (2007CB116306)

＊通讯作者 Tel:86-898-66988061;E-mail:hfdai2001@yahoo.com.cn