番荔枝内生真菌Hypoxylonsp.B38的代谢产物研究

林 筱,鲁春华,黄耀坚,沈月毛

厦门大学生命科学学院药物微生物工程实验室,厦门 361005

番荔枝内生真菌Hypoxylonsp.B38的代谢产物研究

林 筱,鲁春华,黄耀坚＊,沈月毛

厦门大学生命科学学院药物微生物工程实验室,厦门 361005

从番荔枝内生真菌Hypoxylonsp.B38的固体平板发酵提取物中分离到 5个化合物,通过NMR和MS等方法把它们分别被鉴定为Lachnellin D(1)、Dienetriol 9(2)、Lachnellin C(3)、Lachnellin B(4)和Benzo[d][1, 3]dioxol-5-ylmethanol(5)。

番荔枝;Hypoxylonsp.B38;NMR;lachnellin

植物内生真菌是寻找生物活性天然产物的丰富资源,目前已报道从内生真菌中得到的次生代谢产物包括抗生素、抗肿瘤化合物、抗氧化化合物等[1,2]。我们研究的内生真菌来自番荔枝科 (Annona)的番荔枝 (Annona squam osaL.)。从该植物中分离的番荔枝内酯类化合物多达 100多种,且几乎都具有抗肿瘤活性,番荔枝科植物的抗肿瘤药物开发已成为热点。对番荔枝内生真菌进行研究,不仅可以考察番荔枝内生真菌的种群多样性,同时番荔枝内生真菌是重要的微生物资源,对其次级代谢产物进行研究可以发现结构新颖的化合物;本文介绍从其内生真菌Hypoxylonsp.B38分离到的 5个已知化合物。

1 材料与方法

1.1 仪器材料

反相硅胶 RP-18(Merck);凝胶 Sephadex LH-20 (Phammacia);柱层析用硅胶 (200～300目)和硅胶GF254薄层层析板 (青岛海洋化工厂);Bruke ARX600核磁共振仪;Micro Mass-Q TOF质谱仪。

1.2 实验菌株和发酵培养基

实验菌株从采自中国福建省厦门地区的番荔枝植物叶片组织中分离纯化得到。B38通过 ITS序列分子鉴定,确定为Hypoxylonsp.,其 ITS r DNA序列信息已经公布(EF488415)。

马铃薯葡萄糖固体培养基 (PDA):马铃薯去皮,200 g切成小块,加水煮沸 30 min,4～6层纱布过滤,加 20 g葡萄糖,加入 1.5%～2%的琼脂,加水定容至 1000 mL。121℃高压灭菌 20 min。

1.3 方法

1.3.1 菌株Hypoxylonsp.B38的发酵

从 PDA培养基斜面上挑取Hypoxylonsp.B38菌体接种至 PDA平板,28℃培养 3～4 d后挑取菌体,接种至 4 L PDA培养基平板中,28℃培养 14 d。

1.3.2 成分的提取分离

培养物切割成小块状后用乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸 (80∶15∶5)的混合溶液提取,共 3次;合并 3次提取液后,40℃减压浓缩至干,用甲醇溶解过滤得发酵提取浸膏。浸膏用水溶解,用乙酸乙酯萃取至无色,40℃减压浓缩至干,得到乙酸乙酯可溶部分8.0 g。

乙酸乙酯可溶部分 8.0 g经反相中压液相柱层析(RP-18,180 g),依次用 30%、50%、70%、100%甲醇水系统洗脱,每个梯度 2 L,流速为 20 mL/min,每 200 mL收集一管,分别浓缩至干。少量甲醇溶解后,根据 TLC检测结果合并,得 A(1.0 g)、B(2.5 g)、C(1.6 g)、D(1.6 g)、E(1.4 g)五个组分。

A(1.0 g)用经凝胶柱 (Sephadex LH-20,140 g)层析分离,甲醇洗脱,经 TLC检测,合并得 A-1 (800 mg)、A-2(80 mg)、A-3(40 mg)。A-1(800 mg),经反复的中压反相柱层析,30%甲醇洗脱,得到A-1A 28 mg,A-1B 40 mg,A-1C 120 mg。A-1A经反相中压液相柱层析,25%甲醇洗脱,TLC检测合并8-11得化合物 2(2 mg)。A-1B用正相柱层析分离,0.5 g硅胶石油醚饱和装柱,石油醚∶丙酮 (100∶1,80∶1)洗脱,约 5 mL/tube接收,合并 80∶1洗脱出的 42～70管,经薄层层析 (氯仿∶甲醇 =10∶1),硫酸烘烤后,在Rf值约 0.6左右处有紫红色转棕红色的单点,记为化合物 1(14 mg)。A-1C用 2 g硅胶柱层析分离,石油醚饱和装柱,石油醚∶丙酮 (500∶1,250∶1)洗脱,约 6 mL/tube接收,合并 500∶1洗脱的 55～61管,经薄层层析 (石油醚∶丙酮 =5∶1),硫酸烘烤后,在Rf值约 0.5左右处有紫红色转棕黄色的单点,记为化合物 3(12 mg);合并 250∶1洗脱的 104～133管,经薄层层析 (石油醚∶丙酮 =2∶1),硫酸烘烤后,在Rf值约 0.5左右处有紫红色转棕黄色的单点,记为化合物 4(13 mg)。

A-3组分 (40 mg)称取 0.08 g普通硅胶拌样, 0.8 g硅胶,石油醚装柱,石油醚∶丙酮 (200∶1,100∶1)洗脱,约 6 mL/tube接收,合并 100∶1洗脱的 17～26管,经薄层层析 (石油醚∶丙酮 =2∶1),硫酸烘烤后,在Rf值约 0.4左右处有紫黑色的单点,记为化合物 5(3 mg)。

2 结构鉴定

通过中压反相,正相以及凝胶柱层析,共分离到5个化合物,根据NMR以及MS数据鉴定了化合物1～5(图 1),它们分别为Lachnellin D(1),Dienetriol 9(2),Lachnellin C (3),Lachnellin B (4)和Benzo[d]1,3]dioxol-5-y lmethanol(5)。

图 1 化合物 1～5的结构式Fig.1 Structures of compounds 1-5

2.6 化合物 1～5的生物活性

采用MTT法[5]测定化合物 1～5的抗肿瘤活性,指示细胞株为 Hep G2和 HeLa,化合物 1～5在测定浓度为 10μg/mL时没有显示出对肿瘤细胞株Hep G2和 HeLa的活性;采用滤纸片法[6]测定化合物 1～5对指示菌Bacillus subtilisCMCC63501,EscherichiacoliCMCC44103,StaphylococcusaureusATCC9763,Candida albicansAS2.538的活性,结果显示,在每片滤纸片含有 50μg样品时也没有显示出对指示菌株的抑制活性。

1 Tan RX,Zou WX.Endophytes:a rich source of functional metabolites.Nat Prod Reports,2001,18:448-459.

2 Sean FB,Shana MB,Jon C.The Guanacastepenes:a highly diverse family of secondarymetabolites produced by an endophytic fungus.J Am er Chem Soc,2001,123:9900-9901.

3 SemarM,Anke H,ArendholzWR,et al.Lachnellins A,B, C,D,and naphthalene-1,3,8-triol,biologically active compounds from a Lachnellula species(Ascomycetes).Zeitschrift fuerNaturforschung,C:B iosciences,1996,51:500-512.

4 Fuchser J,Zeeck A.Secondary metabolites by chemical screening.Part 34.Aspinolides and aspinonene/aspyrone cometabolites,new pentaketides produced byAspergillus ochraceus.Liebigs Annalen/Recueil,1997,1:87-95.

5 Solis PN,W right CW,AndersonMM,et al.A microwell cytotoxicity assay usingA rtem ia salina(Brine Shrimp).Planta M ed,1993,59:250-252.

6 Kronvall G,Ringertz S.Antibiotic disk diffusion testing revisited.single strain regression analysis.Review article.APM IS, 1991,99:295-306.

Five Compounds fromHypoxylonsp.B38, an Endophytic Fungal Stra in ofAnnona squam osaL.

L IN Xiao,LU Chun-hua,HUANG Yao-jian＊,SHEN Yue-mao
Fujian Engineering Laboratory of Phar maceuticals,School of Life Sciences, Xiam en University,Xiam en 361005,China

Five compounds were isolated from the extract of fermentation broth of endophytic fungus(Hypoxylonsp. B38)ofAnnona squam osaL.On the basis ofNMR andMS data,compounds 1-5 were identified as lachnellinD(1),dienetriol 9(2),lachnellin C(3),lachnellin B(4)and benzo[d][1,3]dioxol-5-ylmethanol(5).

Hypoxylonsp.B38;NMR;lachnellin

R915;Q939.9

A

1001-6880(2010)05-0791-03

2008-12-09 接受日期:2009-02-12

教育部重大项目 (306010)

＊通讯作者 Tel:86-592-2184892;E-mail:yjh@xmu.edu.cn