梯度洗脱法同时快速分离测定不同品种不同部位淫羊藿中 7种异戊烯基黄酮类成分的研究

谢娟平,孙文基

1安康学院化学化工系,安康 725000;2西北大学陕西省生物医药重点实验室,西安 710069

梯度洗脱法同时快速分离测定不同品种不同部位淫羊藿中 7种异戊烯基黄酮类成分的研究

谢娟平1＊,孙文基2

1安康学院化学化工系,安康 725000;2西北大学陕西省生物医药重点实验室,西安 710069

建立一种同时快速分离测定不同品种、不同部位淫羊藿中双藿苷 A、淫羊藿属苷 A、朝藿定 C、淫羊藿苷、淫羊藿属苷 C、意卡瑞苷A和去多甲基羟基淫羊藿素 7种异戊烯基黄酮类成分的梯度洗脱方法,其中双藿苷A、意卡瑞苷A和去多甲基羟基淫羊藿素为首次报道其含量测定。实验比较了三种不同的梯度洗脱条件和三种不同的提取分离条件,选出了实验的最佳条件:采用RP-HPLC法,以美国WATERS SUNFIRET M-C18为色谱柱,乙腈-水为流动相,梯度洗脱 (乙腈:0 min,20%;10 min,40%;15 min,45%;20 min,60%),流速为 1 mL/min,检测波长 270 nm,在此条件下,30 min内所有组分均得到了良好的分离。实验同时考察比较了巫山淫羊藿植株不同药材部位和其它十种不同品种淫羊藿中 7种异戊烯基黄酮类成分的分布。结果表明:不同品种淫羊藿中黄酮类成分的含量差异很大,但大部分品种以朝藿定 C为主;同一品种巫山淫羊藿不同部位中则双藿苷A和朝藿定 C的含量较大 (在巫山淫羊藿根中,两者的含量分别为现行质量控制指标淫羊藿苷的 20倍和 30倍),可见巫山淫羊藿显著不同于其它品种的淫羊藿,朝藿定 C在其药用效果中可能比淫羊藿苷扮演着更重要的角色尤其是在根部作为药用时,这也为民间将巫山淫羊藿根作为小黄连使用提供了一定的实验支持。结论:对于品种较多,分布资源较广的淫羊藿药材,作为药用时,应注意品种和药用部位,考察药材的内在质量,不能一概而论。实验所得到的方法能被用做淫羊藿植株中二次代谢产物分布的快速考察、筛选符合要求的淫羊藿原药材和淫羊藿制备药物中的质量考察。

淫羊藿;异戊烯基黄酮;分离;定量测定;RP-HPLC

淫羊藿为小檗科常用中草药,具有补肾阳、强筋骨、怯风湿的功能[1-3],在中国药用已超过 2000年的历史,广泛用于治疗心血管疾病和其他慢性疾病。中国淫羊藿资源相当丰富,常用品种为朝鲜淫羊藿、箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿、柔毛淫羊藿、淫羊藿等,常用其植株的干燥地上部分,尤其是巫山淫羊藿根在民间作为“小黄莲”来使用,具有较高的临床价值。该属其它植物在个别地区也作淫羊藿用,称习用淫羊藿药材。现代药理研究表明淫羊藿对骨质疏松症有强烈活性[4]。

淫羊藿药材含有多种黄酮类成分[1,5],主要是异戊烯基黄酮,形成了该属独特的黄酮类成分。提取分离实验表明,淫羊藿中主要含有七种黄酮类成分,包括双藿苷 A、淫羊藿属苷A、朝藿定 C、淫羊藿苷、淫羊藿属苷 C、意卡瑞苷A和去多甲基羟基淫羊藿素。其中以淫羊藿苷为代表的 HPLC法含量测定已有许多报道[5,6],中国药典也以淫羊藿苷作为特征性成分规定了含量测定,限度不低于 0.5%[7],但对于淫羊藿药材中七种异戊烯基黄酮成分含量的同时分离与快速测定则未见报道,尤其是双藿苷 A、意卡瑞苷A和去多甲基羟基淫羊藿素的含量测定未见报道。特别是巫山淫羊藿根中的化学成分,在以前的报道中,淫羊藿苷是提取物中的主要有效部分。我们从巫山淫羊藿根中分离到上述七种异戊烯基黄酮,其中巫山淫羊藿根中以双藿苷A和朝藿定 C为主,叶中以朝藿定 C和淫羊藿苷为主;不同品种淫羊藿叶中黄酮类成分的含量差异很大,但大部分品种以朝藿定 C为主。此外上述七种异戊烯基黄酮均显示了一定的抗氧化活性和抗菌活性,其中淫羊藿属苷 C和多甲基羟基淫羊藿素的抗氧化活性强于其它黄酮[8],这也为民间将巫山淫羊藿根作为“小黄连”使用提供了一定的理论支持。因此,测定淫羊藿中黄酮类成分的含量对评价其质量和控制临床研究剂量是必须的。

本研究建立了一种简单有效的 RP-HPLC方法。可用于同时分离分析淫羊藿中七种黄酮类成分,用此方法对采集的不同品种的淫羊藿和同一品种淫羊藿药材不同部位中的七种黄酮类成分进行了快速分离分析考察,结果良好。

1 仪器与试剂

WATERS高效液相色谱仪,包括 2695泵,2487紫外检测器,Empower色谱工作站;微孔滤膜φ=13 mm,4.5μm(天津市色谱科学技术公司)。

乙腈为色谱纯,水为双蒸水并经 0.45μm水系滤膜过滤。对照品均为自行分离精制,并经 UV、I R、FAB-MS、HAMR、CNMR鉴定结构,HPLC检测,面积归一化法计算纯度,均大于 98%(图 2)。

不同品种淫羊藿植物样品由洛阳陆生植物研究所王忠东教授鉴定并提供;两年生巫山淫羊藿由陕西省安康市药品检验所胥道宝主任药师鉴定并提供。

2 方法

2.1 检测波长的选择

双藿苷 A、淫羊藿属苷A、朝藿定 C、淫羊藿苷、淫羊藿属苷 C、意卡瑞苷 A和去多甲基羟基淫羊藿素结构相似(图 1),在本文流动相中的紫外光谱最大吸收均在 270 nm,故选择 270 nm为吸收波长。

图 1 七种对照品结构示意图Fig.1 Structure of seven reference substances

2.2 色谱条件

查阅文献可知,对化合物 2～5的 HPLC分离分析多采用酸性系统流动相[9,10],但这种方法在大量样品的长期分析中,对色谱柱的寿命有非常严重的损害。因此,本文采用不含酸的梯度洗脱方法对化合物 1～7进行分离和分析,结果良好。色谱柱: WATERS SUNFIRET M-C18柱(5μm,4.6×250 mm);流动相:乙腈 -水,梯度洗脱,柱温:25℃;灵敏度0.02AUFS;流速:1 mL/min;检测波长 270 nm;分别采用四种梯度条件进行分离 (表 1),结果在条件 2 (乙腈:0 min,20%;10 min,40%;15 min,45%;20 min,60%)下,七种化合物的分离分析在 30 min内实现,各成分的分离度和保留时间均较好的满足了常规分析要求。在上述条件下,各对照品及样品的色谱图如图 2,七种成分色谱峰理论塔板数分别为8710(1号峰)、4850(2号峰)、21195(3号峰)、 19862(4号峰)、2828(5号峰)、4508(6号峰)、6322 (7号峰),峰间分离度分别为 2.15(1,2峰)5.53 (2,3峰)、2.25(3,4峰)2.33(4,5峰)、3.32(5,6峰)、6.05(6,7峰)。

表 1 化合物 1～7色谱行为与条件的考察Table 1 Chromatographic behavior of compound 1-7 with different HPLC mobile phases

图 2 对照品及样品的HPLC图谱Fig.2 RP-HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.3 对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量,制备成一定浓度的对照品储备液,使浓度分别为:双藿苷 A 0.060 mg/ mL,淫羊藿属苷A 0.0470 mg/mL,朝藿定 C 0.0540 mg/mL,淫羊藿苷 0.0705 mg/mL,意卡瑞苷 A 0.1488 mg/mL,淫羊藿属苷 C 1.6580 mg/mL,去多甲基羟基淫羊藿素 0.9280 mg/mL。

2.4 样品提取方法的考察

预实验表明,淫羊藿中的七种化合物分为两大类群,化合物 1～4可溶于水,而化合物 5～7难溶于水,故实验设计分别取淫羊藿药材各 100 g,以水和70%乙醇分别用超声和回流方法提取,比较产率和含量,确定了最优方法:70%乙醇超声提取 1 h(表2)。

2.5 供试品溶液的制备

取各淫羊藿样品的干燥植物,于 60℃下烘 3 h,取烘干品,粉碎,过 40目筛,精密称取约 0.2 g,置50 mL具塞锥形瓶中,加入 70%乙醇 30 mL,称重,超声提取 1 h,称重并补足减失重量,离心,过滤,弃去初滤液,取续滤液用微孔滤膜 (4.5μm)过滤,作为供试品溶液。

2.6 线性关系的考察

表 2 提取条件的考察 (n=3,药材粉末以 100 g计)Table 2 Results of different extraction procedure(n=3,m=100 g)

精密吸取上述化合物 1～5对照品溶液,依次进样 1、5、10、15、20、25、30、35、40μL,精密吸取上述化合物 6～7对照品溶液,依次进样 1、2、3、4、5、6、7、8、10μL,按色谱条件,实验中分别以信噪比的三倍和 10倍定义检测限LOD和定量限 LQD,测定峰面积,以峰面积为纵坐标,以对照品进样量为横坐标,绘制标准曲线,双藿苷 A、淫羊藿属苷A、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿属苷 C、意卡瑞苷 A和去多甲基羟基淫羊藿素的线性回归方程如表 3。

表 3 对照品线性回归结果Table 3 Determination results of the seven standard substances linear equations

2.7 精密度实验

精密吸取各对照品溶液 20μL,连续进样 6次,测定峰面积,结果 7种成分含量测定值的 RSD分别为:淫羊藿属苷A 1.19%,双藿苷A 1.46%,淫羊藿苷 0.45%,朝藿定 C 0.39%,淫羊藿属苷 C 1.74%,意卡瑞苷 A 0.72%和去多甲基羟基淫羊藿素1.45%。各成分保留时间的 RSD分别为淫羊藿属苷A 0.16%,双藿苷A 0.11%,淫羊藿苷0.09%,朝藿定 C 0.13%,淫羊藿属苷 C 0.31%,意卡瑞苷 A 0.29%和去多甲基羟基淫羊藿素 0.25%。

2.8 重复性实验

取同一样品(两年生巫山淫羊藿根)6份,按样品制备方法制备供试品溶液,各取 20μL进样,测定峰面积,计算得七种成分的含量分别为:2.090%, 0.373%,3.054%,0.106%,1.134%,0.104%, 0.005%,各成分含量的 RSD分别为淫羊藿属苷 A 0.028%,双藿苷 A 0.019%,朝藿定 C 0.062%,淫羊藿苷 0.008%,淫羊藿属苷 C 0.036%,意卡瑞苷A 0.003%和去多甲基羟基淫羊藿素 0.001%。

2.9 对照品稳定性实验

精密吸取混合对照品溶液 20μL分别于配制后的 0、4、8、16、24、48 h内进样,测定峰面积。计算 7种成分的 RSD分别为 0.9%、0.6%、0.8%、0.4%、0.7%、0.5%、0.9%。结果表明,对照品溶液在 48 h内稳定。

2.10 加样回收率

准确称取已测知含量的巫山淫羊藿根样品 5份,每份约 0.2 g,平行操作,分别定量加入淫羊藿属苷A、双藿苷A、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿属苷C、意卡瑞苷A和去多甲基羟基淫羊藿素对照品溶液,待自然挥干后,按供试品溶液制备方法操作,并按上述色谱条件测定峰面积,计算七种成分的平均回收率和 RSD,结果见表 4。

表 4 加样回收率试验结果(n=5)Table 4 Recovery rate of samples(n=5)

由表 4可见七种成分回收率为 97.96%～101.04%,效果良好,表示了样品处理中七种主要成分提取完全。

3 结果

3.1 同一植物不同部位样品含量的测定

取巫山淫羊藿根、茎、叶,按供试品溶液制备方法操作,每次进样 20μL,按照色谱条件测定峰面积,以外标法计算含量,结果见表 5。

表 5 同一样品不同部位的含量测定结果(n=3,%)Table 5 Results of content determination of different samples(n=3,%)

3.2 不同品种样品含量的测定

取不同品种淫羊藿(两年生)的地上部分,按供试品溶液制备方法操作,每次进样 20μL,按照色谱条件测定峰面积,以外标法计算含量,结果见表 6。

表 6 不同品种样品的含量测定结果 (n=3,%)Table 6 Results of content deter mination of different samples(n=3,%)

4 讨论

4.1 本实验采用梯度洗脱方法首次同时分离测定了双藿苷 A、淫羊藿属苷A、朝藿定 C和淫羊藿苷、淫羊藿属苷 C、意卡瑞苷A和去多甲基羟基淫羊藿素七种成分在不同部位、不同品种淫羊藿中的分布,色谱条件稳定,测定结果可靠。由表 5可知,朝藿定C、双藿苷 A、淫羊藿苷在巫山淫羊藿根、叶中较多,而在茎中次之。但值得注意的是巫山淫羊藿各部位中朝藿定 C的含量远远大于淫羊藿苷,尤其是在根中,除主要含朝藿定 C外的另一种成分双藿苷 A的含量也达到 2%,两者的含量分别为现行质量控制指标淫羊藿苷的 20倍和 30倍,可见巫山淫羊藿显著不同于其它品种的淫羊藿,朝藿定 C在其药用效果中可能比淫羊藿苷扮演着更重要的角色 (尤其是在根部作为药用时),这也为民间将巫山淫羊藿根作为小黄连使用提供了一定的实验支持。中国药典对淫羊藿的含量测定项只测淫羊藿叶中的淫羊藿苷,显然不适于巫山淫羊藿品种[7]。

4.2 由表 6可知,不同品种的淫羊藿中主要成分含量有较大差异,但总黄酮的主要部分为这七种化合物,在考虑药材及制剂质量时,对于品种较多,分布资源较广的淫羊藿药材,作为药用时,应注意品种和药用部位,考察药材的内在质量,不能一概而论。实验所得到的方法能被用做淫羊藿植株中二次代谢产物分布的快速考察、筛选符合要求的淫羊藿原药材和淫羊藿制备药物中的质量考察。

4.3 流动相的选择:实验选择了乙腈-水(25∶75)衡流洗脱和乙腈-水(梯度洗脱)体系,考虑到常规分析中的快速测定,从分离情况和出峰时间等综合分析选择乙腈-水梯度洗脱,选择梯度洗脱条件 2(乙腈: 0 min,20%;10 min,40%;15 min,45%;20 min,60%),在 30 min内很好的完成了七种成分的快速分离与分析。

1 Flora of China(中国植物志).Beijing:Science Press,2001. 262.

2 Pan Y,Kong LD,et al.Antidepressant-like effect of icariin and its possible mechanism in mice.Phar m acology B iochemistry and Behavior,2005,82:686-694.

3 Wang YK,Huang ZQ.Protective effects of icariin on human umbilical vein endothelial cell injury induced by H2O2in vitro.Phar m acological Research,2005,52:174-182.

4 Chen K M(陈克明),GeBF(葛宝丰),et al.Inhibitory effect of total flavonoid extractof Ep imedium sagittatum on ratosteoporosis induced by ovariectomy.Chin J Clin Rehabilitation(中国临床康复),2004,8:5681-5683.

5 Guo BL(郭宝林),Xiao PG(肖培根).Deter minationEpimediin flavonoids by HPLC.Northwest Phar m J(西北药学杂志),1996,10(5):201

6 JiaMG(贾敏鸽),SunWJ(孙文基),et al.RP-HPLC determination of rouhuoside and icariin in herbaEpimediiof different species and part used.Chin J Phar m Anal(药物分析杂志),2005,25(1):64.

7 Ch P(中国药典),Vol I.2005.267

8 Xie J,Sun W.Chemical constituents of roots of Epimedium wushanense and evaluation of their iological activities.Natural Product Research,2007,21:600-605.

9 Hao ZF(郝振芳),Zhu ZJ(朱智甲),et al.Determination of icariin in yishenling oral-liquid by second order derivative spectrophotometry.Chin J Spec Lab(光谱实验室),1999,5: 534-536.

10 Sha M(沙明),Xue Y M(薛雅民).Determination of icariin in Koreanum nakai by HPLC.Chrom atogram(色谱),1997, 13:166-167.

Separation and Simultaneous Quantification of Seven Prenylflavones from Organs of differentEpim ediiUsing Gradient Reverse-phase HPLC

XIE Juan-ping1＊,SUN Wen-ji2

1Departm ent of Chem istry,Ankang University,Ankang 725000,China;2B iology and M edicine Key Laboratory of Shaanxi Province,NorthwestUniversity,Xi’an 710069,China

A s imple and rapid gradient reverse-phase HPLC method for separation and simultaneous determination of the seven prenylflavones,diphylloside A,ep imedoside A,Epimediin C,icariin,epimedoside C,icarisoside A,and desmethylanhydroicaritin in different organs(roots,stems,leaves)ofEpimedii wushanensefor the first time has been developed. Especially,diphylloside A,icarisoside A and desmethylanhydroicaritin(never found any reports of the detection by HPLC)were determined inEp im ediifor quality control in the first time,comparison of three RP-HPLC methods and three extraction methods,quantification and comparison of each prenylflavone in leaves ofEpim ediiwushanensewith other nineEpim ediispecies.W ith thismethod,we obtained good retention times and resolution of seven Compounds.Concentration of all seven components varied between plantorgans,Epimediin C was higher than icariin(the Compound typically used to evaluateEpim ediiquality)in leaves ofEpimedii.diphylloside A andEpim ediin C were 20 and 30x higher, respectively,than icariin in the roots ofE.wushanenseT.S.Ying,and the quantification ofEp im ediin C was higher far away from otherEpim ediispecies.Thus,Ep im edii wushanenseis a special species ofEpimedii,Epimediin C is likely to play a more important role than icariin inEp im edii wushanense,especially,roots ofEpim edii wushanenseshould be exploit(it has been used to therapydisease as well asCoptidis phizom ain china in civilian).The method could be applied toseek regularity in secondarymetabolites distribution,screen raw materials in search for highly qualityplants and itsmedical preparations.

Epim edii;prenylflavones;separation;quantitative determination;RP-HPLC

R284;Q946.91

A

1001-6880(2010)05-0820-06

2009-01-07 接受日期:2009-07-06

安康学院高层次人才启动经费资助项目(AYQD ZR200801)

＊通讯作者 Tel:86-915-3261415;E-mail:xjp_731205@163.com