响应面法探讨氯磺酸-吡啶法修饰条件对硫酸化当归多糖取代度的影响

张 帆,王德云,赵晓娜,王君敏,胡元亮

南京农业大学中兽医学研究室,南京 210095

响应面法探讨氯磺酸-吡啶法修饰条件对硫酸化当归多糖取代度的影响

张 帆,王德云,赵晓娜,王君敏,胡元亮＊

南京农业大学中兽医学研究室,南京 210095

用氯磺酸-吡啶法对当归多糖进行硫酸化修饰。用响应面法研究了修饰条件中反应温度 (A)、反应时间(B)和氯磺酸-吡啶比例 (C)三个因素对产物的硫酸基取代度的影响,建立回归模型,验证了其有效性,并分析了主效应和因素交互作用。结果表明,在A为 65～95℃、B为 60～180 min、C为 1:3～14.3范围内,三个因素与产物平均取代度 (Y)的回归模型为 Y=2.74+0.66×A+0.66×B+0.80×C+0.51×A×B-0.31×A×C-0.16 ×B×C-0.34×A2-0.23×B2-0.50×C2;F检验证明模型拟合较好,可以用于量化控制反应条件;三个因素对取代度的影响程度为 C＞A=B,A和B之间存在极显著的交互作用。

响应面法;当归多糖;氯磺酸-吡啶法

硫酸化多糖或多糖硫酸酯是一类糖羟基上带有硫酸根的多糖,具有抗病毒、抗肿瘤、抗凝血和增强免疫等生物学活性。研究发现,一些多糖本来无生物活性或某些生物活性很弱,通过硫酸化修饰以后,能获得新的生物活性或增强某些生物活性[1]。因此,可以运用硫酸化修饰的方法对其进行结构改造,获取更多的硫酸化多糖。多糖的硫酸化修饰方法有多种,其中以氯磺酸-吡啶法最为常用。在氯磺酸-吡啶法中,试剂配比、反应温度和反应时间对修饰的影响较大[2],且硫酸基取代度直接影响硫酸化多糖的生物活性[3]。所以要制备不同取代度的多糖硫酸酯,选用合适的反应条件是关键。

响应面法 (Response Surface Methodology)是采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析优化工艺参数,预测响应值的一种统计方法,能评价在试验区间内,各变量对响应值的影响[4]。本研究用响应面法探讨了反应温度、反应时间和氯磺酸-吡啶比例对当归多糖氯磺酸-吡啶法修饰产物硫酸基取代度的影响,旨在研究 3个因素与产物取代度之间的量化关系,以用于指导制备一定取代度的当归多糖硫酸酯时控制反应条件。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

BS-100A自动部分收集器 (上海沪西分析仪器厂有限公司);透析袋 (上海绿鸟科技发展有限公司);冷冻干燥器 (日本岛津公司);754单光束紫外-可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司);旋转蒸发器RE-52A(上海亚荣生化仪器厂);FA1104N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

Sephadex-G200(pharmacia分装);氯磺酸 (上海实验试剂有限公司);吡啶 (080305,上海凌峰化学试剂有限公司);硫酸钾 (20050406,上海振欣试剂厂);N,N-二甲基甲酰胺 (DMF,T20080115,国药集团化学试剂有限公司)。以上试剂均为分析纯。

1.2 当归多糖的提取和纯化

当归多糖的提取用水煎醇沉法。取当归饮片 1 kg,粉碎后加 10倍水,先用武火加热,待沸腾后改用文火加热 1.5 h,纱布过滤,药渣复煎 2次,合并 3次煎液,加热浓缩至含生药 1 g/mL,2500 r/min离心20 min后抽滤,滤液中加 95%酒精直至最终溶液中酒精含量为 90%,4℃过夜,抽滤收集沉淀,真空干燥,得粗当归多糖。用 Savage法[5]去蛋白,过 DEAE-纤维素 (OH-型,3.0×50 cm)进行分离,用 500 mL蒸馏水洗脱,流速 1 mL/min,分部收集,每管 4 mL,合并洗脱液,减压浓缩后过 Sephadex G-200层析柱进一步纯化[6],Sephadex G-200柱 (2.0×90 cm)上样量 15 mL,蒸馏水洗脱,流速每小时 15 mL,分部收集,每管 3 mL,硫酸-苯酚法[7]显色,在 490 nm下比色检测峰位,收集主峰,冷冻干燥,得纯当归多糖。用硫酸-苯酚法测定其糖含量为91.7%,考马斯亮蓝[8]法测定其蛋白含量为 0.2%。

1.3 当归多糖硫酸化修饰响应面试验设计

选取氯磺酸-吡啶比例、反应温度和反应条件 3个因素,以所制备的当归多糖硫酸酯的硫酸基取代度(DS)为响应值,用Box-Behnken设计了三因素三水平试验。根据文献,3个因素的水平取值区间一般在如下范围:温度 60～95℃,反应时间 1～3 h,氯磺酸-吡啶比率 1∶3～1∶14.29(比值 0.07～0.33),同时考虑模型设计要求取值须在中心点周围对称分布,故所取因素水平中心点为反应温度 80℃、反应时间 2 h、试剂比值 0.25(1∶4)。中心点和中心点两侧的水平取值分别用代号 0、1和-1表示 (表 1),三因素三水平共 17个试验(表 2)。

表 1 当归多糖硫酸化响应面试验因素及水平表Table 1 Factors and levels of RS M test in sulfated modification of angelica polysaccharide

1.4 当归多糖硫酸酯化操作

酯化试剂制备[9]:按表 2设定的氯磺酸-吡啶比例,取无水吡啶置于反应瓶中,经冰盐浴冷却后,边搅拌边逐滴滴加氯磺酸,滴加完毕后按每份含吡啶40 mL分装。共制备氯磺酸-吡啶比为 0.33(1∶3)的酯化试剂 4份,0.07(1∶14.29)的 4份,0.20(1∶4)的 9份,密封冷藏备用。

酯化操作:精密称取纯化的当归多糖 50 mg,悬浮于 10 mL DMF中,加入 1份酯化试剂,按所设定条件置水浴摇床反应。反应结束后,加入 4℃蒸馏水 100 mL,用饱和NaOH调 pH至 7.5,加入 3倍体积无水乙醇,4℃静置过夜,取沉淀自来水透析 2 d,蒸馏水透析 1 d,透析液冷冻干燥,得到当归多糖硫酸酯。

1.5 硫酸化当归多糖取代度测定

用氯化钡-明胶法[10]。取 1 mol/L HCl溶解K2SO4使其浓度为 1.0875 mg/mL,分别吸取该溶液0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.20 mL,用 1 mol/L HCl补足至 0.2 mL,分别加入三氯乙酸 3.8 mL,氯化钡-明胶溶液 1 mL和明胶溶液 1 mL,充分混合后室温静置 15 min,用分光光度计测定混合液 360 nm处的吸光值,记录各组氯化钡-明胶组与明胶组吸光值之差,以硫酸根浓度为横坐标,差值为纵坐标绘制标准曲线。将样品溶于 1 mol/L HCl,配成 1 mg/mL的溶液,100℃水浴中水解 4 h。取 2份 0.2 mL水解液,同法测定氯化钡-明胶组和单一明胶组的吸光值,计算两组之差。将测样差值代入标准曲线,得样溶液中硫酸基浓度 S%,S1%除以样品浓度 (1 mg/ mL)得固体样品中硫酸基的质量分数 S%。按下式计算取代度DS=(1.62×S%)/(32-1.02×S%)。

1.6 回归模型的建立

以 17次试验反应条件编码值 (A、B、C)为自变量,以产物的DS为响应值 (Y),用 SAS软件拟合多元回归模型:Y=k0+k1×A+k2×B+k3×C+k4× A×B+k5×A×C+k6×B×C+k7×A2+k8×B2+ k9×C2,求最佳 k0～k9值,生成回归方程。

1.7 回归模型的有效性分析

对回归方程进行方差分析,将总方差变异来源拆分为回归模型、失拟指数 (lack of fit value)和纯误差 3项。如果回归模型未达到显著水平 (P＞0.5),表示该模型不适合用来解释和预测此试验;如果失拟指数达到显著水平(P＜0.5),表示各试验点实际值偏离理论值过大,拟合效果较差。

1.8 主效应分析

将方差分析结果中模型变异来源拆分成各因素及其交互项,根据 F值判定其对响应值的影响是否显著,及影响程度大小。

1.9 因素交互影响分析

分别将 3个因素中的 1个因素编码值取 0,得到其他 2个因素对响应值影响的方程,作相应的三维曲面图和等高线图分析这种影响的变化趋势,并进一步分析达到显著水平的交互效应。

1.10 回归模型的有效性验证

将A、B、C分别取值为-1、-1、1,在此条件下重复 3次试验,试验结果用 t检验判定是否与理论值相符。

2 结果与讨论

2.1 响应面试验响应值

17次试验结果见表 2。

表 2 当归多糖硫酸化修饰响应面试验设计及响应值Table 2 Dsign and response values of RS M test in sulfated modification of angelica polysaccharide

7 2.4277 8 0 0 0 2.4914 9 0 0 0 2.5591 10 1 -1 0 1.5359 11 0 1 1 3.2159 12 0 0 0 3.0172 13 1 1 0 4.0753 14 0 -1 -1 0.4746 15 -1 0 1 2.3148 16 -1 0 -1 0.1230 17 -1 -1 0 1.2812 0 0 0

2.2 回归模型

硫酸基平均取代度 (Y)与反应温度 (A)、反应时间(B)、酯化试剂比例 (C)三因素编码空间的多元回归模型为 Y=2.74+0.66×A+0.66×B+ 0.80×C+0.51×A×B-0.31×A×C-0.16×B×C -0.34×A2-0.23×B2-0.50×C2。

2.3 回归模型的有效性

回归模型的方差分析结果见表 3。

表 3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表 3可见,失拟指数P值为 0.8832,远大于0.05,表明回归方程无失拟因素存在,回归式拟合得较好。回归方程显著性检验 P值小于 0.01,表明回归方程达到极显著,在试验范围内可以用来解释和预测试验结果。

2.4 回归模型的主效应

回归模型的参数估计值见表 4。

表 4 回归模型参数估计值Table 4 Parameter estimate value of regression model

模型Model 9 15.5376 1.7264 20.868 0.0003＊＊A 1 3.4586 3.4586 41.8065 0.0003＊＊B 1 3.4780 3.4780 42.0408 0.0003＊＊C 1 5.0664 5.0664 61.2407 0.0001＊＊AB 1 1.0526 1.0526 12.7234 0.0091＊＊AC 1 0.3917 0.3917 4.7352 0.0660 BC 1 0.1020 0.10197 1.2325 0.3036 A21 0.5000 0.5000 6.0434 0.0436＊B21 0.2291 0.2291 2.7694 0.1400 C21 1.0734 1.0734 12.9750 0.0087＊＊

由表 4可见,模型中 A、B、C、AB、C2的 P值分别为 0.0003,0.0003,0.0001,0.0091,0.0087,均小于 0.01,表明它们对当归多糖硫酸化产物平均取代度有极显著的影响。而 AC、BC、A2、B2的 P值均大于 0.05,表明其对取代度影响不显著 (P＞0.05)。同时,根据 F值大小可推知,试剂比例对当归多糖硫酸酯硫酸取代度的影响最大,反应时间和反应温度对其影响几乎相同。即试剂比例 ＞反应时间 =反应温度。

2.5 因素的交互影响

2.5.1 反应温度和反应时间对取代度的影响

反应时间A和反应时间B对产物取代度 Y的影响的回归方程为 Y=2.74+0.66×A+0.66×B +0.51×A×B-0.34×A2-0.23×B2,相应的三维曲面图和等高线图见图 1。图的曲面呈斜向上坡形,表明在试验范围内,随着反应温度的上升和反应时间的延长,产物取代度增高。等高线呈外密内疏,表明在较低反应温度,提高温度对取代度的影响比较高温度时大。反应时间对取代度的影响也是同样。

图 1 反应温度和反应时间对产物取代度的影响Fig.1 Effects of reaction temperature and time on DS of product

表 4中 PAB=0.091,P＜0.01,表明反应温度A与反应时间B的交互作用极显著。在 A编码取-1、0、1时,Y随B的变化曲线如图 2。在试验范围内,三条曲线均斜向上,表明在各个温度下,产物取代度随时间延长而升高;温度较高时的曲线位置比温度较低时高,表明温度越高,相同反应时间时产物取代度越高;温度较高的曲线的斜率比温度较低时大,表明随温度上升,产物取代度对反应时间的敏感性越高,即温度越高,延长相同反应时间,产物取代度的上升量越高。

值得注意的是,95℃线与 80℃线在反应时间接近 1.5 h时有交点,而从 95℃线和 65℃线的趋势来看,它们很有可能在反应时间为 1 h以内的某个位置也有交点。这表明在反应时间较短的情况下,较低的反应温度得到的产物的取代度可能会比较高温度时高,这极有可能是因为反应机理的不同而引起的。也就是说,较高温度可能会使反应机理发生变化,这很有可能会导致产物结构的差异。

图 2 65,80,95℃时反应时间对产物取代度的影响Fig.2 Effects of reaction time on DS of product at 65,80 and 95℃

2.5.2 反应温度和试剂比例对取代度的影响

反应温度A和试剂比例 C对产物取代度 Y的影响的方程为 Y=2.74+0.66×A+0.80×C-0.31×A×C-0.34×A2-0.50×C2,相应的三维曲面图和等高线图见图 3。

图 3 反应温度和氯磺酸-吡啶比例对产物取代度的影响Fig.3 Effects of reaction temperature and ratio of chlorosulfonic acid to pyridine on DS of product

图的曲面呈陡坡向上,逐渐平缓后略有下降,表明起初取代度 Y随着反应温度 A和试剂比例 C的上升而升高,升高幅度逐渐减小;当到达某一点时,反应温度 A和试剂比例 C再升高时,Y即开始下降。即反应温度 A和试剂比例 C在过低或过高的情况下,Y均不能达到有效最高值。根据 Y对A、C的方程运算可知,当A取值在 0.6即反应温度为 89℃,C取值为 0.6即试剂比值为 0.298(1∶3.36)时, Y得到最大值。A、C的交互作用未达到显著(PAC＞0.05)。

2.5.3 反应时间和试剂比例对取代度的影响

反应时间B与试剂比例 C对产物取代度 Y的影响的方程为 Y=2.74+0.66×B+0.80×C-0.16×B×C-0.23×B2-0.50×C2,相应的三维曲面图和等高线图见图 4。

图 4 反应时间和氯磺酸-吡啶比例对产物取代度的影响Fig.4 Effects of reaction time and ratio of chlorosulfonic acid to pyridine on DS of product

图的曲面呈陡坡向上,逐渐平缓后略有下降,结合等高线图,最高点落在 C取值范围内而在 B取值范围外。这表明在试验范围内,Y随着 B的增加而升高,但升高的幅度减缓;随着 C的提高,取代度 Y呈现先上升后下降的变化。根据 Y对B、C的方程运算,可知在 B取值为 1即反应时间为 3 h,C取值为 0.6即试剂比值为 0.298(1∶3.36)时,Y得到最大值。C对 Y的影响体现的是反应物对反应产物的影响。一般来说,提高反应物浓度,有利于反应向正反应方向进行,在氯磺酸-吡啶比例 C比较低时属于这种情况。当试剂比例逐渐提高,当大于 0.298时,产物取代度反而随试剂比例上升而下降,这表明有不利于反应的因素产生。这有可能是在酯化试剂的制备过程中,高氯磺酸比例造成的产物板结[11,12],致使制备的酯化试剂的有效成分比低氯磺酸比例时反而低,也有可能是高比例的氯磺酸使反应体系 pH过低,反而使取代反应平衡向相反方向移动[13],这还需进一步试验验证。B、C的交互作用未达到显著

(PBC＞0.05)。

2.6 回归模型的有效性验证

A、B、C分别取值为-1、-1、1时,回归模型预测的DS值为 2.13。3次重复试验的DS均值为 2.103 ±0.07,|t|=0.4158＜t0.05,2,P＞0.05,这表明实际值与理论预测值差异不显著,说明该模型的预测条件与实际情况较符合。

本试验通过Box-Behnken设计建立了当归多糖硫酸酯的平均取代度与反应温度、反应时间、酯化试剂氯磺酸-吡啶比例的三因素的回归模型,该模型拟合较好,可以用于量化控制反应条件。三个因素对当归多糖硫酸酯取代度的影响为试剂比例 ＞反应温度 =反应时间,反应温度和反应时间之间存在极显著的交互作用。

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Effects ofM odification Conditions on Degree of Substitution of Sulfated Angelica Polysaccharide by Response SurfaceM ethedology

ZHANG Fan,WANG De-yun,ZHAO Xiao-na,WANG Jun-min,HU Yuan-liang＊
Institute of Traditional Chinese Veterinary M edicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China

Angelica polysaccharide wasmodified by chlorosulfonic acid-pyridine method.The influences of reaction temperature(A),reaction t ime(B)and the ratio of chlorosulfonic acid to pyridine(C)on the degree of substitution(DS) of productionwere studied by response surfacemethodology(RS M).Recursive modelwas established,the validity of the modelwas tested and the main effect and interaction of the factors were analysed.The results indicated that within the range ofA being 65-95℃,B being 60-180 min and C being 1:3-1:14.3,the regressionmodel between three factors and average DS(Y)was Y=2.74+0.66×A+0.66×B+0.80×C+0.51×A×B-0.31×A×C-0.16×B×C-0.34×A2-0.23×B2-0.50×C2.The F test proved that the model possessed well fit and could be used to control the reaction conditions.The influencing degree of three factorsonDSwasC＞A=B.Therewas extremely significant interaction between A and B.

response surface methodology;angelica polysaccharides;chlorosulfonic acid-pyridine method

Q946.91;R284.1;S853.72

A

1001-6880(2010)05-0830-06

2008-12-16 接受日期:2009-02-26

国家自然科学基金项目 (30871887,30571360);南京农业大学青年科学基金项目(KJ07015)

＊通讯作者 Tel:86-25-84395203;E-mail:ylhu@njau.edu.cn.