单棕榈酰莽草酸的高效液相色谱-蒸发光散射检测法定量测定

孙 阳,汤鲁宏＊

江南大学医药学院生物制药系,无锡 214122

单棕榈酰莽草酸的高效液相色谱-蒸发光散射检测法定量测定

孙 阳,汤鲁宏＊

江南大学医药学院生物制药系,无锡 214122

本文建立一种采用高效液相色谱 -蒸发光散射检测法定量测定单棕榈酰莽草酸的方法。色谱条件:色谱柱:反相 Symmetry C18柱 4.6×250 mm i.d.(填料粒度 5μm),柱温 30℃,流动相:乙腈 -水 -甲酸 (80∶20∶0.2);流速 0.8 mL/min;ELSD漂移管温度:80℃,载气流速:2 L/min。3-,4-和 5-棕榈酰莽草酸纯品采用酶法合成,合成产物经柱层析和高效液相色谱制备纯化得到纯品。在该色谱条件下,3-,4-和 5-棕榈酰莽草酸在 0.21～4.12μg的范围内,其质量与其峰面积线性关系良好(r=0.9991,0.9998,0.9997),回收率分别为 95.2～98.7%, 96.1%～98.2%,96.3%～98.5%;RS D分别为1.6%,1.8%,1.9%。实验结果表明该方法具有简便、快速、准确、重现性较好的特点,可以用于定量分析单棕榈酰莽草酸,尤其适用于非水相酶促反应合成体系中的产物检测。

单棕榈酰莽草酸;莽草酸;定量测定;HPLC;ELSD

单棕榈酰莽草酸 (Monopa lmityloxy Shikimic Acid,m-PSA),包括 3-,4-和 5-棕榈酰莽草酸 (3-,4-和 5-PSA,结构见图 1),是一类化学新单体 (ChemicalNew Entity),属脂溶性莽草酸类衍生物。

莽草酸 (Shikimic Acid,结构见图 1)是一种从中药木兰科植物八角茴香中提取的具有生理活性的天然产物[1],有抗血栓和减轻局灶性脑缺血损伤的作用,同时也是抗 H5N1型禽流感特效药“达菲”合成原料。马怡等[2]报道 SA对二磷酸腺苷 (ADP)诱导大脑中动脉栓塞(MCAT)模型大鼠的血小板聚集率有较强的抑制作用;静注和肌注 SA均使小鼠血凝时间延长。

莽草酸具有极性大,亲水性好 (在水中的溶解度能达到 180 g/L)等理化性质,导致莽草酸难以透过血脑屏障,生物利用度不高,严重影响了治疗效果。

单棕榈酰莽草酸的合成提供了一种脂溶性莽草酸新品种[3]。关于单棕榈酰莽草酸的分析检测,目前已经建立了 TLC定性分析方法,定量分析方法的建立迄今作者未见国内外有任何报道。

本文采用反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法(RP-HPLC-ELSD)建立了一种简便、快速、准确、重现性较好的单棕榈酰莽草酸定量分析方法。

图 1 莽草酸,3-棕榈酰莽草酸,4-棕榈酰莽草酸和 5-棕榈酰莽草酸的结构Fig.1 Structures of Shikimic acid(SA),3-Monopalmityloxy shikimic acid(3-PSA),4-Monopalmityloxy shikimic acid(4-PSA)and,5-Monopalmityloxy shikimic acid(5-PSA)and their corresponding calculated log P(calculated by ChemSketch)

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

HPLC:Agilent 1100高效液相色谱仪;检测器: Alltech蒸发光散射检测器 2000;HPLC-MS:色谱仪: Waters 2695;检测器:Waters 996;色谱柱:Sunfire C18柱 2.1×150 mm i.d(填料粒度 5μm);柱温∶35℃;流动相:甲醇-水-甲酸 (80∶20∶0.2);流速为 0.3 mL/min;检测波长 210nm;质谱仪:Waters Z MD4000;离子源:ESI电离源,电喷雾离子化负离子采集模式 (ESI-),m/z范围:200～800 amu,离子源温度:103℃,脱溶剂气温度:300℃,脱溶剂气流量:280 L/h,毛细管电压:3.5 kV,锥孔电压:25 V。UN ITY INOVA 400核磁共振仪。

莽草酸 (纯度 ＞99%,HPLC,购自陕西华腾公司),棕榈酸 (分析纯,中国医药上海化学试剂站),甲醇,正己烷,氯仿,乙醚,乙酸乙酯,甲酸 (分析纯),高碘酸溶液,0.5%(w/v),亚硫酸钠-氢氧化钠溶液 (亚硫酸钠溶液为 0.0555 mol/L,氢氧化钠溶液为 1 mol/L,氢氧化钠和亚硫酸钠的混合液体积比为 3∶2)。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品的制备

于 250 mL具塞三角瓶中加入无水叔戊醇 100 mL,莽草酸 1 g,棕榈酸 11 g。封口后于 55℃恒温水浴振荡器中振荡 (150 r/min)平衡 30 min,加入0.1 g固定化脂肪酶 Novozeme 435,反应 32 h,反应结束后过滤除去固定化酶和分子筛。高碘酸显色薄层定性检测单酰化物的存在。所用硅胶 G薄层板规格为 20 cm×10 cm×0.2 cm,展开剂为氯仿-甲醇-正己烷-甲酸(体积比为 5∶1∶1∶0.1),显色剂为高碘酸溶液 0.5%(w/v),亚硫酸钠-氢氧化钠溶液 (亚硫酸钠溶液为 0.0555 mol/L,氢氧化钠溶液为 1 mol/L,氢氧化钠和亚硫酸钠的混合液体积比为 3∶2)。在该薄层色谱条件下,各组分的比移值Rf为∶莽草酸 0.17,单酰化物 0.5,棕榈酸 0.63。

将除去固定化酶和分子筛的反应液旋转蒸干,用正己烷配制成浓度为 1 g/mL,在一根 40×500 mm具塞砂芯过滤层析柱中上样、正己烷 2个柱体积,乙醚 2个柱体积 (此时上样固体几乎消失),氯仿-甲醇(5∶1)3个柱体积,甲醇 1个柱体积作为流动相,依次洗脱,回收氯仿-甲醇收集液溶剂,得预纯化的单棕榈酰莽草酸。

原料进行预纯化浓缩蒸干后,将所得预纯化产物配成甲醇浓溶液,取3 mL进行制备分离。以甲醇∶水∶甲酸 (85∶15∶0.2)为洗脱液恒流洗脱。205 nm,210 nm双通道紫外检测,分别收集三个单峰。旋转蒸发除去溶剂,常温下真空干燥 12 h,得到三种组分,然后用高效液相色谱,质谱,氢核磁共振谱分析制备得到的组分的结构,得出三种组分为 3,4,5位分别酰化的单棕榈酰莽草酸。

分别精确称取 3-,4-和 5-棕榈酰莽草酸 1.27, 1.10,1.13 mg溶于 10 mL甲醇,得到 3-,4-和 5-棕榈酰莽草酸浓度分别为 0.127,0.11,0.113 mg/mL的标准溶液。

1.2.2 样品的制备

在合成反应进行中分别于反应 0,2.5,3.5, 4.5,5.5,6.5,8,9.5,11,12.5,14,16,23,27,32 h取样,过滤除去分子筛、固定化脂肪酶及不溶底物,得样品溶液,供测定。

1.2.3 色谱条件

色谱柱:SymmetryC18柱 4.6×250 mm i.d(填料粒度 5μm);柱温:30℃;流动相:乙腈-水-甲酸 (80∶20∶0.2);流速为 0.8 mL/min;ELSD漂移管温度为:80℃,载气流速:2 L/min。

2 结果与讨论

2.1 3-,4-和 5-棕榈酰莽草酸的结构分析

将制备得到的三种组分分别经 HPLC,MS分析,结果如图 2,3。经质谱电喷雾负离子检测,其准分子离子质荷比均为 411-,符合单棕榈酰莽草酸分子量(412)。经 1H NMR分析,可进一步确定高效液相色谱制备得到的 1号峰为 4-PSA,2号峰为 3-PSA,3号峰为 5-PSA。

1号峰 (4-PSA1H NMR)δ:12.417(s,1 H), 6.613(d,1 H),5.167(s,1 H),5.119(t,1 H), 4.821(m,1 H),4.387(s,1 H),3.93(t,1 H), 2.397(d,1 H),2.302(t,2 H),2.131(d,1 H), 1.497(m,2 H),1.234(m,24 H),0.869(t,3 H)。2号峰(3-PSA1H NMR)δ:12.483(s,1 H),6.468 (d,1 H),5.424(s,1 H),5.051(s,1 H),5.026(t, 1 H),3.851(t,1 H),3.761(m,1 H),2.502(d,1 H),2.327(t,2 H),2.119(d,1 H),1.538(m,2 H),1.237(m,24 H),0.853(t,3 H)。3号峰 (5-PSA1H NMR)δ:12.422(s,1 H),6.632(d,1 H), 5.004(s,1 H),4.991(m,1 H),4.963(t,1 H), 4.172(s,1 H),3.672(t,1 H),2.671(d,1 H), 2.288(t,2 H),2.132(d,1 H),1.494(m,2 H), 1.234(m,24 H),0.869(t,3 H)。

2.2 色谱条件选择

合成原料中棕榈酸、莽草酸以及单棕榈酰莽草酸对紫外光吸收较弱,仅在低波长处有点吸收,采用紫外检测器进行检测时,响应信号较弱,特别是棕榈酸难以检测到,且低波长检测受流动相影响较大,如果溶剂质量不高,背景噪音较大,检测灵敏度更低。如果采用示差折光检测器进行检测时,检测灵敏度也很低,难以达到量较低时的检测要求,为此,我们采用了蒸发光散射检测器进行检测,取得了理想的效果。

图2 制备样品的HPLC图谱Fig.2 HPLC of components separated by preparative HPLC

图 3 制备样品的质谱图Fig.3 MS spectra of components separated by preparative HPLC

有关单酰化莽草酸的检测分析,国内外尚未见有研究报道。我们试验了多种品牌的 C18色谱柱,发现 Symmetry C18(4.6×250 mm i.d,填料粒度 5μm)色谱柱在分离度及分析时间上优于其他色谱柱。然后用此色谱柱对流动相进行了优化,由于分析目标物都具有酸基,所以在流动性中添加一定量的酸来改善峰型,试验了乙腈-水-甲酸、甲醇-水-甲酸、乙腈-水-乙酸、甲醇-水-乙酸等梯度洗脱条件,结果发现,三种不同的单棕榈酰莽草酸分离效果并不理想,且梯度洗脱比较麻烦。而采用乙腈-水-甲酸 (80∶20∶0.2)体系等强度洗脱时得到了良好的分离效果,能够将 3-,4-和 5-棕榈酰莽草酸以及合成原料棕榈酸和莽草酸全部分开(图 4),分离效果也优于甲醇-水-甲酸、乙腈-水-乙酸、甲醇-水-乙酸体系。

图 4 单棕榈酰莽草酸的高效液相色谱图Fig.4 analysis of Monopa lmityloxy Shikimic acid with HPLC-ELSD

1.874∶莽草酸(SA)8.267∶4-PSA 8.669∶3-PSA 9.364∶5-PSA 12.796∶棕榈酸 (PA)

2.3 线性范围

分别精密吸取 3-,4-和 5-棕榈酰莽草酸对照品溶液 2、5、10、20、40μL,以峰面积 A(mv.s)的对数值为纵坐标(Y),进样量 m(μg)的对数值为横坐标(X),进行线性回归。分别得到三种单棕榈酰莽草酸的回归方程,结果如表 1所示。

表 1 三种单棕榈酰莽草酸的回归方程结果Table 1 Results of the regression equations with three kinds of theMonopa lmityloxy Shikimic acid

2.4 精密度实验

取对照品溶液连续测定 7次进行精密度测定,每次进样 20μL。用峰面积的相对标准偏差 (RSD)表示,得 3-PSA的 RSD为 1.6%,4-PSA的 RSD为1.8%,5-PSA的 RSD为 1.9%。可见实验测定重复性很好。

2.5 回收率实验

取相同已知浓度的样品溶液 3份,分别加入 3种浓度水平的混合对照溶液,以 3次进样测定的平均值计算,测得 3-PSA的回收率为 95.2%～98.7%,4-PSA的回收率为 96.1%～98.2%,5-PSA的回收率为 96.3%～98.5%。

2.6 单棕榈酰莽草酸合成过程中产物浓度的测定

以叔戊醇为反应介质合成单棕榈酰莽草酸。在合成反应进行中,分别于反应 0,2.5,3.5,4.5,5.5, 6.5,8,9.5,11,12.5,14,16,23,27,32 h取样进行测定,结果见图 5。从图 3可见反应 24 h生成的三种单棕榈酰莽草酸达到平衡。单棕榈酰莽草酸的终浓度为:4.6 mmol/L。

图 5 合成产物中单棕榈酰莽草酸的浓度随反应时间的变化Fig.5 Change of the concentration as the change of the time in the synthesis process of Monopalmityloxy Shikimic acid

3 结论

单棕榈酰莽草酸 (Monopalmityloxy Shikimic Acid,m-PSA)是一类化学新单体 (Chemical New Entity),属脂溶性莽草酸类衍生物。对于莽草酸的酰化产物研究的报道,仅限于莽草酸的三乙酰化产物和单乙酰化产物,其分析方法主要是高效液相。对于莽草酸与棕榈酸的单酰化产物的定量分析研究国内外均未见报道。本文采用反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法 (HPLC-ELSD)定量分析了非水相酶促反应合成产物中的三种单棕榈酰莽草酸。该方法具有简便、快速、准确、重现性较好的特点。同时为化学新单体单棕榈酰莽草酸的进一步研究打下了基础。

1 Frost K.Shikimic acid.Narendra Ambhaikar Group Meeting. 2005.12.1.

2 Ma Y(马怡),Sun JN(孙建宁),XuQP(徐秋萍),et al.Inhibitory effects of shikimic acid on platelet aggregation and blood coagulation.Acta Phar m Sinica(药学学报),2000,35 (1):1-3.

3 You YZ(尤永真),Lv GY(吕圭源),Ni ZN(倪竹南).The advance of researches on the pharmacological functions and mechanism of shikimic acid and its derivatives.Chin A rchives Tradit Chin M ed(中华中医药学刊),2007,25:386-387.

Quantitative Determ ination of theM onopalm ityloxy Shikim ic Acid by HPLC with ELSD

SUN Yang,TANGLu-hong＊
Department of M olecular&Phar m aceutical B iotechnology of School of M edicine& Phar m aceutics in Jiangnan University,W uxi 214122,China

To establish a method to deter mine the monopalmityloxy shikimic acid quantitatively,high Perfor mance Liquid Chromatographywith EvaporativeLight-ScatterDetectorwas tested and optimized.The deter minationwas carried outon a Symmetry C18(4.6×250 mm i.d.,particle size 5μm)columnwithAcetonitrile-water-for mic acid(80∶20∶0.2)as the mobile phase.The column temperature was 30℃.The flow rate was 0.8 mL/min.The drift tube temperature and nitrogen carrier gas flow rate of ELSD were set at 80℃and 2 L/min,respectively.Monopalmityloxy Shikimic Acid was synthesis using theNovozeme 435.Then prepare through the column chromatography and HPLC.Under such chromatographic conditions,for 3-,4-and 5-pa lmityloxy shikimic aicd,the sample substance,the linear range was 0.21-4.12μg,and good(r=0.9991,0.9998,0.9997),the average recovery was 95.2%-98.7%,96.1%-98.2%,96.3%-98.5%,respectively,and the relative standard deviation was 1.6%,1.8%,1.9%,respectively.This method is simple,rapid,and accurate with good reproducibility and can be used for the quantitative deter mination ofmonopa lmityloxy shik imic acid, particularly suitable for the performance assessing and monitoring of the non-aqueous bio-catalyzed monopalmityloxy shikimic acid synthesis system.

monopa lmityloxy shik imic acid;shikimic acid;quantitative determination;HPLC;ELSD

R284;Q946.91

A

1001-6880(2010)05-0836-04

2009-02-20 接受日期:2009-04-20

＊通讯作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:tangluhong@msn.com