传统中藏药材小秦艽中 20种氨基酸的测定

孙 菁,李法强,徐文华,陈桂琛＊

1中国科学院西北高原生物研究所,青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室,西宁 810001;2中国科学院青海盐湖研究所,西宁 810008

传统中藏药材小秦艽中 20种氨基酸的测定

孙 菁1,李法强2,徐文华1,陈桂琛1＊

1中国科学院西北高原生物研究所,青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室,西宁 810001;2中国科学院青海盐湖研究所,西宁 810008

以 1,2-苯并-3,4-二氢咔唑-9-乙基氯甲酸酯 (BCEOC)作为柱前衍生化试剂,采用梯度洗脱实现了传统中藏药材小秦艽中 20种氨基酸衍生物的基线分离,利用电喷雾离子源 (ESI Source)正离子模式,实现了小秦艽中氨基酸的定性测定,可为秦艽类药用植物资源化学成分的深入开发利用提供依据。结果表明,所建立的方法线性范围宽、重复性较好,大多数氨基酸衍生物的线性回归系数大于 0.9990,检测限为 6.5～178.2 fmol。小秦艽中氨基酸组成丰富,至少含有 18种氨基酸和 7种人体必需氨基酸,营养价值较高。同一氨基酸成分在不同采样点表现出不同含量,体现了小秦艽该类成分的地理分布差异特征。氨基酸成分与生态环境的相关分析结果显示只有纬度与Lys之间达到了极显著的负相关关系,其余各因子之间均未达到显著水平,说明纬度对小秦艽氨基酸含量有较大的影响。

小秦艽;BCEOC;氨基酸;生态环境

小秦艽 (Gentiana dahuricaFischer)为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属多年生草本,是我国著名的传统中藏药材,收载于 2005版《中国药典》[1]和藏药志中[2]。其生于海拔 800～4500 m的草原阳坡、河谷阶地等生境下,在我国主要分布于四川北部及西北部、西北、华北、东北等地区[3];以干燥根入药,可用于治疗扁桃体炎、荨麻疹、风湿性关节炎等症[1,2]。目前,对小秦艽的研究主要集中在其 rRNA序列的分析[4]、龙胆苦苷含量的测定[5]以及化学成分的分析上[6],有关其氨基酸含量的测定尚未见报道。氨基酸是广泛分布于动植物体内的有机氮化合物,是构成生物体的蛋白质的重要组成,在生物体内发挥着重要的生理生化作用[7,8],同时也是许多中药药用价值的评价标准之一[9-11]。因此,本文采用新型高灵敏度荧光试剂 1,2-苯并-3,4-二氢咔唑-9-乙基氯甲酸酯 (BCEOC)[12]作为柱前衍生化试剂,室温下在乙腈溶剂中以硼酸钠缓冲溶液控制反应体系的 pH=9.0,10 min即可衍生完全。衍生物稳定性好,衍生产率高,衍生溶液不必预处理可直接进样分析。在乙腈/水作流动相的条件下,采用梯度洗脱达到了 20种氨基酸衍生物的完全基线分离,实现了小秦艽根部氨基酸的快速、准确分析,可为秦艽类药用植物的治病机理、合理用药以及深入开发利用提供一定的理论依据。

1 实验部分

1.1 实验材料

小秦艽根部采自青海省 8个不同地方 (表 1),以 GPS记录海拔和经纬度。采集后,混匀去除杂土等,自然状态下风干,粉碎,过 100目筛,待分析用。

表 1 采样点生态环境调查数据Table 1 Ecological environmental data of sampling localities

1.2 仪器与试剂

Agilent1100型高效液相色谱 -质谱联用仪(Agilent公司)配备四元梯度泵,在线真空脱气机,荧光检测器 (Fluorescence Detector),100位自动进样器,电喷雾电离源 (Electrospray Ionization Source, ESI Source),HypersilBDS C18色谱柱 (4.6 mm×200 mm i.d.,5 mm,大连依立特公司)。BCEOC由山东曲阜师范大学尤进茂教授实验室合成,氨基酸标准样品 (Sigma公司),色谱纯乙腈(禹城化学试剂厂),其它试剂均为分析纯,纯水由Milli-Q超纯水系统制备。

图1 BCEOC与氨基酸衍生反应概况Fig.1 Derivatization scheme ofBCEOC with amino acids

1.3 标准溶液的配制

准确称取定量氨基酸标准品,加入少量 6 mol/L的盐酸溶解后用 6 mol/L的氢氧化钠溶液调至中性,然后用 pH=9.0的硼酸钠缓冲溶液定容配成1.0×10-2mol/L的溶液,相应低浓度氨基酸标准液(5.0×10-4mol/L)以色谱纯乙腈稀释而成。称取32.6 mgBCEOC,用无水乙腈溶解并定容至 10 mL,其浓度为 1.0×10-2mol/L。低浓度的衍生试剂 (1.0 ×10-3mol/L)用无水乙腈稀释而成。

1.4 氨基酸标准品的衍生过程

向 1.5 mL安培瓶中依次加入 160μL乙腈,300 μL硼酸钠缓冲溶液 (pH=9.0),15μL混合氨基酸,60μL衍生试剂溶液,于 30℃至 40℃水浴中反应 10 min,加入 10μL 30%的乙酸溶液调至弱酸性后即可直接进样分析。衍生反应概况如图 1。

1.5 样品的制备

参照文献[13]方法进行:称取约 100 mg粉碎后的样品,置于 1.5 mL安培瓶中,加入 6 mol/L盐酸溶液 1mL,密封后在 110℃水解 24 h,过滤,用N2吹干后用 1 mL pH=9.0的硼酸钠缓冲溶液溶解,定容到 10 mL容量瓶中,相应浓度为 1000 ng/μL。低浓度的水解溶液(10 ng/μL)用 pH=9.0的硼酸钠缓冲溶液稀释而成。

1.6 色谱及质谱条件

色谱柱:HypersilBDS C18色谱柱 (4.6 mm×200 mm i.d.,5 mm,)。流动相 A:30%乙腈水溶液 (含有 30 mmol/L的甲酸,用氨水调至 pH=3.7),B: 50%的乙腈,C:95%的乙腈。流速为 1.0 mL/min,进样量为 10μL,柱温 30℃。荧光激发和发射波长分别为:λex=333 nm,λem =390 nm。梯度洗脱程序见表 2。

电喷雾离子源 (ESI Source)正离子模式 (positive ion mode),喷雾压力为 241.32 kPa,干燥气流量为 9 L/min,干燥气温度 350℃,毛细管电压3500V[14,15]。

表 2 梯度洗脱程序Table 2 Chromatographic gradient conditions eluted on HypersilBDS C18column

2 结果

2.1 标准品的色谱分离及质谱鉴定

按照标准品的衍生过程进行衍生后,在 HypersilBDS C18色谱柱上以乙腈/水作流动相,采用梯度洗脱在 65 min内实现了 20种氨基酸衍生物的完全分离,结果见图 2,所有衍生物均可获得较好的基线分离。各分析组分的定性采用电喷雾电离源(ESI Source)进行在线的柱后质谱鉴定,质谱数据见表 3。

2.2 线性回归方程、检测限及回收率

不同浓度的氨基酸标准品溶液分别进样 10 μL,标品的进样量在 105.6 pmol～51.6 fmol范围内,依据各氨基酸衍生物的峰面积和进样量进行线性回归,所得回归方程﹑相关系数和各种氨基酸衍生物检测限见表 3。各氨基酸衍生物的线性相关系数均在 0.9990以上,检测限在 6.5～178.2 fmol之间 (按 S/n=3:1计算)。在制备得到的小秦艽根部水解氨基酸样品中加入一定量的氨基酸标准品后,按照上述衍生化条件和色谱分离条件进行分析测定,所得 20种氨基酸衍生物的回收率均大于 93%。在相同洗脱条件下,对 53 pmol氨基酸衍生物进行六次平行测定,保留时间相对标准偏差 RSD小于0.05%,峰面积相对标准偏差 RSD小于 2.3%,各种氨基酸衍生物保留时间和峰面积的重现性见表 3。

2.3 样品的色谱分离和含量测定

按照 1.6项下色谱分离条件,对制备后的样品分析其水解氨基酸,色谱分离图见图 3,含量测定结果见表 4。

图 2 20种氨基酸标准品的色谱分离图Fig.2 Chromatogram of twenty amino acid standards derivatized with BCEOC

表 3 20种氨基酸衍生物的线性回归方程及相关指标(n=6)Table 3 Linear regression equations,and correlation index of 20 amino acid derivatives(n=6)

图 3 小秦艽样品中水解氨基酸代表性色谱分离图Fig.3 Chromatographic separation of hydrolyzed amino acid fromG.dahuricasamples

2.4 氨基酸类成分与生态环境的相关分析

利用 SPSS统计软件中的相关分析方法对小秦艽中氨基酸类成分与生态环境的相关性进行分析(表 5),结果表明只有纬度与 Lys之间达到了极显著的负相关关系 (P＜0.01),即纬度越高,Lys的含量越低;其余各因子之间均未达到显著水平。

3 讨论

表 4 小秦艽根部水解氨基酸含量(mg/g,n=3)Table 4 Contents of hydrolyzed amino acid fromG.dahuricaroots(mg/g,n=3)

BCEOC试剂对氨基酸的测定具有较高的灵敏度[12],此方法能够准确定量且具有线性范围宽、重

注:“-”表示未检出。下同。Note:“-”refers to undetected.

表 5 小秦艽氨基酸与生态环境相关分析Table 5 Correlation coefficient matrix between amino acids inG.dahuricaand ecological environments

注:0.01水平时相关系显著。Note:＊＊Correlation coefficient is significant at the level of 0.01(2-tailed).

现性好等优点,在氨基酸的分析研究中具有重要的作用。应用于小秦艽氨基酸含量的测定,取得了较好的效果。

在所测定的 20种氨基酸中,小秦艽药用部位富含 18种氨基酸,氨基酸种类较丰富,其含量测定结果与另一藏药波棱瓜的结果近似[11],其中包括 7种人体必需的氨基酸 (Thr,Val,Ile,Leu,Phe,Try, Lys),占氨基酸总量的 24.78%,有较高的营养价值。必需氨基酸的缺乏可减低体液的免疫反应,如Try能够维持正常的抗体生成,Phe缺乏使抗体不能发生正常的反应。必需氨基酸的缺乏,还可引起抗体合成的障碍。因此,氨基酸既可作为营养成分,提供或补充生命体的生命活动所需,又可用来防治多种疾病。其中Arg,Asp和 Glu对于治疗肝胆类疾病有直接的作用效果[16],小秦艽中 Asp平均含量较高(3.333 mg/g),其具有的药理生物活性是否与上述氨基酸组成和含量有关尚需进一步药理研究证明。

由表 4可以看出,同一氨基酸成分在不同采样点含量不同,以含量较高的Asp为例,其最高含量达到 10.377 mg/g,最低含量则为 0.806 mg/g,相差 12倍之多。显示出小秦艽氨基酸类成分的地理分布差异特征。氨基酸类成分与环境因子的相关分析结果显示,纬度越高,即越往北的地方,小秦艽中 Lys含量越低。可见,纬度是影响小秦艽中氨基酸含量的首要因子。同时也表明,环境是决定药用植物化学成分的一个重要因素[17]。

致谢:本研究中衍生试剂 BCEOC由山东曲阜师范大学尤进茂教授实验室赠送,实验过程中得到了赵先恩等同学的热诚帮助,在此一并表示感谢。

1 Pharmacopoeia of P.R.China,Vol.1(中华人民共和国药典(一部)).Beijing:Chemical Industry Press,2005.210.

2 Yang YC(杨永昌).Tibetan Medicines(藏药志).Xining: Xining People’s Press,1991.11.

3 Ho TN,Liu S W.A worldwide monograph of Gentiana.Beijing:Science Press,2001.174-175.

4 Ji KP(姬可平),Zhang XL(张西玲),Liu LS(刘丽莎),et al.Primary study on measuring the internal transcribed spacer I regions of rRNA genein seeds ofGentiana dahurica.China J Chin M atM ed(中国中药杂志),2003,28:313-316.

5 Ni H(倪慧),MakhabelB(波拉提·马卡比力),Qing DG (卿德刚),et al.Determination and comparison of gentiopicroside of various parts of five species of genus Gentiana collected from Xinjiang by TLCS.J Chin M ed M at(中药材), 2004,27:500-501.

6 Yang J(杨婕),Ma J(马骥),Zhou DX(周东星),et al. Study on the chemical constituents ofGentiana dahurica.Chin Tradit Herb D rugs(中草药),2006,37:187-189.

7 Aslam M,Travis RL,Rains DW.Differential effect of amino acids on nitrate uptake and reduction systems in barley roots.Plant Sci,2001,160:219-228.

8 Li XZ,Larson DE,Glibetic M,et al.Effect of glutamine on the induction of nitrate reductase.Physiol Plantarum,1995, 93:740-744.

9 WangDG(王德贵),Yao HY(姚惠英),Su Z W(苏中武).Analyses on the amino acids and trace elements of 3 species of Prunella.J Plant Resources and Environ(植物资源与环境学报),1994,3(4):61-62.

10 Hong YL(洪燕龙),Du SY(杜守颖),Yang G(杨刚),et al.瓜蒌皮药材及其注射液中总氨基酸的含量测定方法研究.Chin J Experim TraditM ed For m ulae(中国实验方剂学杂志),2004,10(3):10-12.

11 Li YL(李玉林),Zhou CF(周昌范),Wang HL(王洪伦),et al.Analysis of amino acids in TibetanMedicine Herpetospermum penduculosum.Am ino Acids&B iotic Resources(氨基酸和生物资源),2005,27(4):11-12.

12 You JM,Ming YF,Shi Y W,et al.Development of a sensitive fluorescence derivatization reagent 1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazole-9-ethyl chloroformate(BCEOC)and its application for deter mination of amino acids from seeds and bryophyte plants using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection and identification with electrospray ionization mass spectrometry.Talanta,2005,68:448-458.

13 WeissM,MannebergM,Juranville JF,et al.Effect of the hydrolysismethod on the determination of the amino acid composition of proteins.J Chrom atogrA,1998,795:263-275.

14 Ndjoko K,Wolfender JL,Hostettmann K,et al.Determination of trace amounts of ginkgolic acids in Ginkgo biloba L.leaf extracts and phytophar maceuticals by liquid chromatographyelectrospray mass spectrometry.J Chrom atogr B,2000,744: 249-255.

15 Friso S,Choi S W,Dolnikowski GG,et al.A method to assess genomic DNA methylation using high-perfor manceliquid chromatography/electrospray ionizationmass spectrometry.A-nal Chem,2002,74:4526-4531.

16 Yu CL(余传隆).氨基酸与人类健康.Am inoAcids&B iotic Resources(氨基酸和生物资源),1999,21(4):4-8.

17 Tao SH(陶曙红),Wu FE(吴凤锷).Effect of ecological environment on active constituents of medicinal plants.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发),2003,15:174-177.

Determ ination of 20 Hydrolytic Am ino Acids in an Important Tibetan and Chinese M edicineGentiana dahurica

SUN Jing1,L I Fa-qiang2,XU Wen-hua1,CHEN Gui-chen1＊

1Q inghai Key Laboratory of Q inghai-Tibet Plateau B iological Resources,Northwest Institute of Plateau B iology,Chinese Academ y of Sciences,Xining 810001,China;2Q inghai Institute of Salt Lakes,Chinese Academy of Sciences,Xining 810008,China

A s imple and sensitive method for the determination of 20 amino acids in an important Chinese and Tibetan medicineGentiana dahuricausing pre-column derivatization-reversed phase HPLC with fluorescence detection and mass spectrometric identification was developed.1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazole-9-ethyl chlorofor mate(BCEOC)was used as the fluorescence derivatization reagent.20 amino acid derivativeswere separated on a HypersilBDS C18columnwith a good baseline resolution and detected with the fluorescence of which excitation and emission wavelengths of derivatives were set at 333 and 390 nm,respectively.Experimental results indicated that the established method had good repeatability and the correlation coefficients for the amino acids derivatization were＞0.9990.The detection limit range(at single-to-noise of 3:1)was 6.5-178.2 fmol.The identification of amino acid derivatives from hydrolyzedG.dahuricawas obtained on the basis of ESI detection atpositivemode.The composition of amino acids inG.dahuricawas abundant and showed higher nutritional value,ofwhich there were 18 amino acids and 7 necessary amino acids for the health of people.The same amino acid had different concentration level in different sampling locality and presented the characteristics of geographical differentiation.Correlation coefficient matrix be tween amino acids and ecological environments showed that there was no significance among the rest factors except that latitude had a significant negative correlation relationship with Lys at the level of 0.01.Thus,at the present study,the ecological environment,especially the latitude, was one of the important factors influencing the chemical constituents of herbalmedicines.The established method could be used and provided reference for the further development and utilization ofGentianaspecies.

Gentiana dahuricaFischer;BCEOC;amino acids;ecological environments

R917;R927.2;Q948.11

A

1001-6880(2010)05-0840-06

2008-12-02 接受日期:2009-03-30

国家中西部专项(2001BA901A47)项目

＊通讯作者 Tel:86-971-6143900;E-mail:gcchen@nwipb.ac.cn