反相高效液相色谱法测定青蒿中青蒿酸的含量

孙景灿,曾建立,赵 兵,袁晓凡,王晓东

1中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京 100190;2中国科学院研究生院,北京 100049

反相高效液相色谱法测定青蒿中青蒿酸的含量

孙景灿1,2,曾建立1,2,赵 兵1＊,袁晓凡1,王晓东1

1中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京 100190;2中国科学院研究生院,北京 100049

本文建立了反相高效液相色谱快速测定青蒿中青蒿酸含量的方法。色谱条件为:Diamonsil C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm,5μm),柱温为 (30±1)℃,流动相采用乙腈与 0.2%磷酸水溶液混合液 (体积比 65:35),流速 1 mL/min,检测波长 220 nm。标准曲线回归方程:Y=8.784573×10-8X-6.443559×10-5,r=0.9997,青蒿酸回收率为 102.4%。实验证明该方法稳定可靠、精密度高、重现性好、简单可行,适用于青蒿酸的分析检测。

青蒿;青蒿素;前体;青蒿酸;反相高效液相色谱

从青蒿 (Artem isia annuaL.)中提取分离的青蒿素作为最有效的抗疟药物已得到世界公认,而且随着青蒿素新用途的不断发现,其资源需求量将越来越大,但不少青蒿中青蒿素含量低 (≤0.3%),无法用于提取青蒿素。研究发现青蒿中青蒿素含量和青蒿酸含量呈相反规律,如山西广灵产的青蒿中青蒿素含量为 0.1%左右,而青蒿酸的含量达到 0.5%,是青蒿素含量的 5倍[1]。青蒿酸 (Artemisinic acid)最早是由中科院上海药物所邓定安等从山东产青蒿丙酮提取物中分离得到,并分析了其结构和性质[2]。青蒿酸是一种倍半萜类化合物,无色方形晶体,分子式为 C15H22O2,分子中含有一个羧基,显弱酸性,能溶于NaHCO3溶液和石油醚、丙酮及醇类等有机溶剂[2,3]。在青蒿素合成代谢途径中,青蒿酸是青蒿素合成的重要前体物质之一[4,5]。虽然青蒿酸也具有一定的抗疟疾活性,但其活性远低于青蒿素[6],因此青蒿酸的利用一直未能引起重视。青蒿酸不仅可以作为青蒿素合成前体,还具有抗肿瘤等多种活性[7],我国低青蒿素含量的青蒿资源分布广泛、产量巨大,具有青蒿酸生产的原料优势。

在青蒿酸提取、分离和转化成青蒿素的过程中,需要对青蒿酸含量变化进行准确和快速的检测。目前有关青蒿酸的分析检测都是以青蒿素为主要分析对象的前提下进行,而青蒿酸与青蒿素同时检测时,需要采用特殊的检测器,分析时间大大延长。如在HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS同时分析检测青蒿素、青蒿酸和青蒿乙素的方法中,就需要使用电喷射电离-四极时间飞行器与质谱进行样品处理和检测,分析过程复杂[8],在 HPLC-UV-ELSD的检测方法中需同时使用紫外和蒸发光散射两种检测器,分析时间长达 40 min左右[1]。因此,研究建立青蒿酸快速准确检测方法对低青蒿素含量青蒿资源的利用和青蒿酸的开发均具有重要意义。

本文针对青蒿酸建立了 RP-HPLC-UV的分析检测方法,该方法不需要特殊的设备,而且分析方法稳定性好、精密度高、时间短、过程简单,可以作为青蒿酸定量分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

岛津LC-20 AT高效液相色谱仪 (日本岛津公司),包括 SPD-M20A二级管阵列检测器、S IL-20A自动进样器、LCsolution液相色谱工作站;8002型恒温水浴控制器(余姚明伟仪表厂);RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);TDL-5-A型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试剂与药品

不同产地青蒿、青蒿酸对照品 (中国中医科学院中药研究所,纯度 98%);乙腈 (Fisher公司)、无水甲醇 (Fisher公司)为色谱纯;磷酸 (北京化学试剂公司)、无水乙醇 (天津市福晨化学试剂厂)均为分析纯。

1.3 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱 (250 mm ×460 mm,5 μm),流动相为乙腈和 0.2%磷酸水溶液,等梯度洗脱,两相体积比为 65:35,分析时间为 25 min,流速为 1 mL/min,进样量为 10μL,检测波长为 220 nm,柱温为 (30±1)℃。

1.4 标准溶液配制

精确称取青蒿酸对照品 3.25 mg,用无水甲醇溶解并定容至 50 mL,得到浓度为 0.0650 mg/mL的标准溶液备用。在 2.3所述色谱条件下分析得到青蒿酸对照品的 HPLC色谱图如图 1所示,青蒿酸保留时间为 20.56 min。

图 1 青蒿酸对照品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of artemisinic acid reference substance

1.5 样品制备

取 1 g粒度为 80目的青蒿原料,放于 100 mL具塞三角瓶中,加入 50 mL无水乙醇浸泡 1 h,超声提取 3次,每次 30 min,离心取上清得到青蒿提取液。进样前用 0.22μm的微孔膜过滤,按 2.3所述HPLC色谱条件分析,色谱图如图 2所示,样品溶液中的青蒿酸出峰时间 20.60 min,与图 1中青蒿酸对照品出峰时间一致。

图 2 青蒿酸样品溶液 HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of artemisinic acid sample solution

2 结果

2.1 检测波长选择

图 3是青蒿酸对照品在 190～400 nm之间的全波长扫描图,由图可知青蒿酸在 195 nm处有最大紫外吸收。在这个波长下,洗脱剂中乙腈和甲醇的吸收也很强(乙腈的最大吸收波长 190 nm,甲醇为 205 nm),如果波长选定为195 nm,洗脱剂的会对青蒿酸检测产生影响;但是乙腈和甲醇在 220 nm处紫外吸收较弱,而青蒿酸在 220 nm下的吸收较强,所以选择 220 nm为检测波长。

图 3 青蒿酸对照品在 190～400 nm间的紫外吸收光谱图Fig.3 Ultraviolet absorption spectrogram (190-400 nm)of artemisinic acid reference substance

2.2 流动相选择

与甲醇相比,乙腈对青蒿酸的洗脱能力更强,与水混合后产生的柱压也更低,所以选择乙腈为洗脱溶剂。但是仅使用乙腈与水的混合液为洗脱溶剂时,色谱峰有拖尾现象,为改良峰形,避免拖尾,选择0.2%磷酸水溶液作为洗脱缓冲溶液。

图 4为不同流动相配比条件下的色谱图,A、B、C、D中上部分为青蒿酸对照品的色谱图,下部分为提取液样品的色谱图。如图所示,当乙腈-磷酸缓冲溶液配比为 55∶45和 60∶40时,目标峰与杂质峰可以分开,但峰的纯度较低,且保留时间过长 (图 4A、4B);提高有机相浓度可缩短保留时间,当乙腈-磷酸缓冲溶液配比调整为 70∶30时,洗脱能力较强,保留时间缩短,但是青蒿酸与其他杂质的峰重合,无法分开(图 4C);进一步调整乙腈-磷酸缓冲溶液配比为 65∶35时,目标物质峰可与杂质峰分开,峰形较好,纯度较高,且出峰较快 (见图 4D),故选择洗脱溶剂配比为 65∶35。

图 4 不同流动相配比条件下青蒿酸对照品溶液和样品溶液色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of artemisinic acid reference substance solution and sample solution with different mobile phase ratios

2.3 流速选择

图 5是样品在不同洗脱流速(A、B、C、D依次为0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min)下的色谱图。当流速为0.6 mL/min和 0.8 mL/min时,保留时间分别为 35. 94 min(5A)和 25.84 min;提高流速,可以缩短分析时间,当流速提高到 1.2 mL/min时,青蒿酸在 17. 40 min即可出峰(5D),但是此时,柱压升高,会影响色谱柱寿命;综合考虑 1.0 mL/min(5C)的流速比较适宜,出峰较快,峰形也好。

2.4 标准曲线及检出限的测定

分别取 2.4中所制备的青蒿酸对照品溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL加入 5 mL容量瓶定容,得到青蒿酸浓度分别为 0.0026、0.0078、0.0130、0.0182、0.0234 mg/mL的 5个对照品溶液。进样10 μL进行检测,记录数据并以峰面积为(X)为横坐标,样品浓度 (Y)为纵坐标,绘制标准曲线,如图 6所示。回归方程为Y=8.784573×10-8X-6.443559 ×10-5,相关系数r=0.9997。最低检出限为 1.7 μg/mL(S/N=3)。

图 5 青蒿酸样品溶液在不同洗脱剂流速下的色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of artemisinic acid sample solution in different flow rates

图 6 青蒿酸标准曲线Fig.6 Calibration curve of artemisinic acid

2.5 稳定性的测定

取浓度为 0.0338 mg/mL的标准溶液,每 2 h测一次,12次测定峰面积结果见表 1,相对标准偏差为RSD=0.25%,表明该方法在 24 h内稳定性。

2.6 精密度的测定

取浓度为 0.0338 mg/mL的标准溶液重复检测 5次,实验结果见表 2,峰面积 RS D值为 0.28%,保留时间的RS D值为0.26%,表明该方法检测精密度较高。

2.7 重现性的测定

按照 2.5中所述方法制备 5份供试液,分别在同样的色谱条件下测定青蒿酸含量,分析数据见表3,计算 RSD值为 1.96%,表明该方法重现性较好。

表 1 检测方法稳定性试验数据Table 1 Test data of the detection method’s stability

表 2 检测方法精密度试验数据Table 2 Test data of the detection method’s precision

表 5 不同产地青蒿中青蒿酸的含量Table 5 Artemisinic acid content inA rtem isia annuaL.grown in different places

表 3 检测方法重现性试验数据Table 3 Test data of the detection method’s repeatability

2.8 加标回收率的测定

精确称取同一批已知青蒿酸含量的样品 0.05 g,共 6份,加入适量浓度为 0.6055 mg/mL的对照品溶液,按照 2.5中制备样品溶液的方法进行提取准备待测液,按照上述色谱分析方法分析检测,计算回收率(表 4),RSD为 1.97%(n=6)。

表 4 加标回收率实验Table 4 Standard addition recovery test

2.9 样品的测定

分别以贵州遵义、重庆酉阳以及湖南三个产地的青蒿为原料,按照 2.5所述方法制备青蒿酸样品溶液,采用上述反相高效液相色谱方法进行检测,检测结果见表 5,5个样品中青蒿酸含量最高可达到1.4 mg/g,可以用来生产青蒿酸从而充分利用青蒿资源。

3 总结

本文建立了反相高效液相色谱检测青蒿酸的方法,选择反相 C18柱,以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相(体积比 65∶35),在 30℃的温度下于 220 nm处检测。检测结果表明:该方法具有良好的稳定性、重现性及精密度,青蒿酸保留时间显著缩短,可以用于青蒿中青蒿酸的快速检测。

青蒿酸具有重要研究开发价值,用于青蒿酸提取的青蒿资源丰富。本文建立的反相高效液相色谱法可以快速准确地检测青蒿酸含量,可以为青蒿资源有效利用和青蒿酸研究开发奠定基础。

1 ZhangD(张东),YangL(杨岚),YangLX(杨立新),et al. Determination of artemisinin,arteannuin B and artemisinic acid in herbaA rtem isiae annuaeby HPLC-UV-ELSD.Acta Phar m Sin(药学学报),2007,42:978-981.

2 DengDA(邓定安),Zhu DY(朱大元),Gao YL(高耀良),et al.Study on the structure of Artemisinic acid.Chin Sci Bull(科学通报),1981,19:1209-1211.

3 Misra LN,Ahmad A,Thakur RS,et al.Crastal structure of artemisinic acid:A possible biogenetic precursor of antimalarial artemisinin fromA rtem isia annua.J Nat Prod,1993, 56:215-219.

4 Jung M,Elsohly HN,Mc Chesney JD.Artemisinic acid: averstile chirasython and bioprecursor to natural products.Planta M ed,1990,56:624-626.

5 Browna GD,Syb LK.In vivotransformations of artemisinic acid inA rtem isia annuaplants.Tetrahedron,2007,63:9548-9566.

6 Zhou S W(周生伟),Wang SL(王莎莉),Wang YP(王亚平).Inhibitory effects of artemisinic acid on proliferation of K562 cellsin vitro.J Chongqing M ed Univ(重庆医科大学学报),2006,31:159-162.

7 SunWC(孙玮辰),Han JX(韩家娴),YangWY(扬蔚怡),et al.Antitumor activities of 4 derivatives of artemisinic acid and artemisinin Bin vitro.Acta Phar m Sin(中国药理学报),1992,13:541-543.

8 Filip CW,Nieuwerburgh V,Sofie RF,et al.Quantitation of artemisinin and its biosynthetic precursors inA rtem isia annuaL.by high perfor mance liquid chromatography– electrospray quadrupole t ime-of-flight tandem mass spectrometry.J ChromatogrA,2006,1118:180-187.

Determ ination of Artem isin ic acid inA rtem isia annuaL.by RP-HPLC

SUN Jing-can1,2,ZENG Jian-li1,2,ZHAO Bing1＊,YUAN Xiao-fan1,WANG Xiao-dong1

1National Key laboratory of B iochem ical Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China;2Graduate University of Chinese Academ y of Sciences,Beijing 100049,China

A method for detecting the content of artemisinic acid which is the key precursor of artemisinin inA rtem isia annuaL.by RP-HPLC was established.Itwas carried out in a Diamonsil C18column(250 mm ×4.6 mm,5μm)at (30±1)℃.Acetonitrile combinedwith 0.2%phosphoric acid aqueous solution(65:35,V/V)was used as the mobile phase at a flow rate of 1 mL/min,and the detection wavelength was 220 nm.The calibration curve equation wasY= 8.784573×10-8X-6.443559×10-5(r=0.9997).A recovery rate of 102.4%was achieved.The results proved that thismethed was suitable for detecting artemisinic acid with good stability,high precision,strong reproducibility,and simple operation.

A rtem isia annuaL.;artemisinin;precursor;artemisinic acid;RP-HPLC

R284.1;Q946.91

A

1001-6880(2010)05-0846-05

2009-01-09 接受日期:2009-03-18

国家高技术研究发展计划(863)基金 (2007AA021501)

＊通讯作者 Tel:86-10-82627059;E-mail:bzhao@home.ipe.ac.cn