磁珠富集法筛选实验豚鼠微卫星分子标记

朱 亮，蔡月琴，屠 珏，应华忠，徐剑钦，陈民利

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心，杭州 310053)

磁珠富集法筛选实验豚鼠微卫星分子标记

朱 亮，蔡月琴，屠 珏，应华忠，徐剑钦，陈民利

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心，杭州 310053)

目的 直接从实验豚鼠基因组DNA中筛选获得微卫星分子标记。方法 应用磁珠和生物素标记的微卫星探针与豚鼠基因组酶切片段杂交，捕获200～1000 bp含有微卫星序列的DNA片段，连接到pMD－18V载体中，转化到感受态细胞E.coli DH5α中构建富集微卫星序列的小片段插入文库。然后用PCR法进行筛选。结果 从约2000个转化子中获得240个阳性克隆。对其中98个进行了测序，并成功设计豚鼠微卫星引物17对。结论 经过优化的磁珠富集法能够稳定、高效地获得豚鼠微卫星标记。本研究获得的微卫星位点将成为豚鼠遗传学研究的有力工具。

豚鼠;磁珠富集法;微卫星

豚鼠是一种具有特殊的生物学特性和生理解剖特点的动物。该物种易被致敏，体内血清补体含量在实验动物中最高，皮肤对毒物刺激反应灵敏且接近人类，体内不能合成维生素C，耳壳大且听力敏锐，因而一直被大量应用于过敏性哮喘研究、免疫学研究中补体的获得、局部皮肤刺激试验、试验性坏血病的研究以及耳科学的研究［1］。另外，豚鼠个体小，性情温顺，容易饲养和抓取，这些特点都使其成为一种被广泛使用的实验动物。

微卫星DNA(microsatellite DNA)是指以几个核苷酸(一般为1～6个)多次重复组成的串联序列。由于高度可变区核心序列重复数目的不同，产生了DNA的多态性［2］，又被称为简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)，其长度大多在100 bp以内。

小鼠、大鼠、沙鼠、家兔、犬、猪和猕猴等实验动物的微卫星标记都有专门的报导并且被应用于实验动物遗传图谱构建、数量性状位点定位、标记辅助选择、遗传多样性评估和遗传监测等领域，推动了人类疾病动物模型建立、功能基因定位和克隆、实验动物品系保持和新品系培育等研究工作的进步［3－8］。豚鼠在遗传背景上与大小鼠、家兔等物种差别比较大［9，10］，无法借鉴这些物种的微卫星位点进行扩增。

本研究从豚鼠基因组中分离筛选出17个微卫星位点，建立豚鼠微卫星文库，为深入研究豚鼠遗传学特征和功能提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂和仪器

本研究使用的Dunkin Hartley种实验豚鼠由浙江中医药大学实验豚鼠生产基地提供［SCXK(浙)2008－0037］。研究使用的主要试剂有:Taq DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶 Sau3AⅠ、DL2000 DNA Marker、DH5α 感受态细胞、pMD18－T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(AXYGEN)购自杭州晓逸科技有限公司。研究使用的主要仪器有:紫外分光光度计(Thermo);PTC－200 PCR 扩增仪(Bio－rad);恒温混匀器 Thermomixer comfort 5355(Eppendorf);水平电泳系统(GE);凝胶成像系统(UVP)。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠基因组DNA的提取和酶切:采集豚鼠肌肉样品2 g，剪碎放入1.5mL离心管，加入370mL TNE 缓冲液、100 μL 10%SDS、10 μL 的 10mg/mL蛋白酶K和20 μL的1 mol/L DTT。混匀后，置于56℃消化过夜。使用酚－氯仿－异戊醇法提取基因组DNA［11］。无水乙醇沉淀，TE缓冲液溶解后用紫外分光光度计测定浓度和纯度。用限制性内切酶Sau3AⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测，切下200～1000 bp片段，用试剂盒(Axygen)回收备用。

1.2.2 基因组片段同接头的连接

1.2.2.1 接头的制备:寡核苷酸链A(GGCCAGAGA CCCCAAGCTTCG)和B(CCGGTCTCTGGGGTTCGAA GCCTAG－PO4)由上海生工生物工程公司合成。将A、B链配成200 pmol/μL溶液，等比混合使终浓度为100 pmol/μL。将混合液升温至80℃变性10 min，室温冷却1 h，以形成带有限制性酶切位点(Sau3A I)的双链接头。最终形成的接头为:

A.GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG

B.CCGGTCTCTGGGGTTCGAAGCCTAG－PO4

1.2.2.2 片段同接头的连接:取经过回收纯化的基因组DNA酶切片段和合成好的接头进行连接，连接体系 50 μL［DNA 1.5 μg;接头 (10 μmol/L)5 μL;10× T4 DNA Buffer 10μL;T4 DNA Ligation 3 μL;ddH2O补足］。16℃连接5 h，连接结束后，升温至65℃灭活10 min。以此连接产物为模板，寡核苷酸链A为引物进行 PCR扩增，扩增体系为50 μL(模板DNA 100 ng，10mmol/L Tris－HCl，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，150 μmol/L dNTP，0.3 μmol/L 寡核苷酸链A，1.25单位的TaKaRa ExTaq DNA聚合酶)，反应程序为:95℃预变性4 min;94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 90 s，共30次循环;72℃延伸 10 min。产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如果接头与割胶回收的DNA片段成功连接，则PCR产物将在琼脂糖凝胶上产生约200～1000 bp的条带。PCR产物用回收试剂盒(Axygen)纯化备用。

1.2.3 杂交及磁珠捕获重复片段

1.2.3.1 探针的合成:根据 Genbank资料设计(AC)12、(AG)12和(AAC)8三个探针，由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3.2 杂交:杂交体系为100 μL(PCR富集的连接产物800 ng左右;探针 0.1 μmol/L;12×SSC 50 μL;ddH2O)，95℃变性 30 min，然后转到 1.5mL 离心管中杂交5～6 h。各探针的杂交温度如下:(AC)12和 (AG)12为70℃，(AAC)8为60℃。

1.2.3.3 磁珠的准备:将10 mg/mL的磁珠(Roche)在包装瓶中混匀后取30 μL于1.5mL离心管中，加入 1× W/B buffer(10mmol/L Tris－HCl，1mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl)300 μL 缓慢冲冼，用自备的磁铁吸附管壁约1 min，分离磁珠与漂洗液，弃漂洗液。重复上述步骤2次。最后加入200 μL 1×W/B buffer备用。

1.2.3.4 片段捕获:将100 μL杂交液加至已准备好的磁珠混合液中，43℃温浴30 min，期间不断振荡，防止磁珠沉淀。然后加入 200 μL 2×SSC，0.1%SDS的溶液漂洗两次，每次5 min;加入200 μL 1×SSC，0.1%SDS的溶液在 45℃漂洗两次，每次5 min;加入 200 μL 1×SSC和 0.1%SDS的溶液，并于60℃漂洗两次，每次5 min。最后一次加入60 μL TE与磁珠混匀后于95℃变性30 min后，迅速用磁铁吸附管壁，并将含有捕获片段的TE移至新的1.5mL离心管备用。

以含有捕获片段的TE作为模板，再次用PCR检测生物素标记的探针和磁珠是否捕获了含有微卫星的目的片段(反应体系及条件同上)。PCR产物割胶回收纯化，以去除多余的引物和没有参加反应的dNTP，用紫外分光光度计检测浓度，备用。

1.2.4 连接转化和筛选鉴定:取PCR纯化产物与pMD－18T载体连接，用热激法将连接产物转入DH5α感受态细胞，将感受态细胞涂布于含有氨苄青霉素、X－gal和IPTG的 LB平板培养基上，37℃培养过夜。挑选白色菌落至LB液体培养基中，37℃250 r/min振荡培养4 h。取振荡培养好的菌液进行PCR 检测，10 μL 体系(菌液 1 μL，2mmol/L Tris－HCl，10mmol/L KCl，0.4mmol/L MgCl2，30 μmol/L dNTP，0.03 μmol/L 寡核苷酸 A 链，0.03 μmol/L 探针，0.25单位的TaKaRa ExTaq DNA聚合酶)。PCR产物PCR扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中拍照记录。

经鉴定为阳性克隆的菌液经再次振荡培养后送送交上海英骏生物技术有限公司。用通用引物(M13+/M13－)进行测序。

1.2.5 引物设计与检测

1.2.5.1 引物设计:挑选含有微卫星片段的序列，用引物设计软件Primer Permier 5.0设计引物并送上海生工生物技术公司合成。

1.2.5.2 引物性能检测:通过PCR反应，检测设计合成引物在扩增过程中的稳定性和特异性。反应体系为 10 μL(模板 DNA 50 ng，10mmol/L Tris－HCl，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，150 μmol/L dNTP，上、下游引物各 1 μmol/L，0.5 单位的 TaKaRa Taq DNA聚合酶)。反应程序为:95℃预变性4 min;94℃ 30 s，各引物适宜退火温度 30 s，72℃ 30 s，共30次循环;72℃延伸10 min。

将上述扩增所得的DNA片段在1.5% 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，用凝胶成像系统拍照记录。

2 结果

2.1 酶切及加接头扩增结果

选用限制性内切酶Sau3AⅠ对豚鼠基因组DNA进行酶切，结果表明，37℃ 5 h的酶切反应获得了理想的效果(图1)。接头连接后PCR反应得到的片段长度主要集中在200～1000 bp范围内(图2)，能够满足实验要求。

图1 豚鼠基因组DNA提取结果和酶切结果图Fig.1 Profile of the guinea pig genomic DNA and digested DNA

图2 PCR检测接头连接的DNA的电泳图谱Fig.2 Profile of the PCR testing of ligation success

2.2 磁珠富集及克隆测序结果

如果捕获成功，则PCR产物将在琼脂糖凝胶上产生约200～1000 bp的条带［12］。图3所示的结果，表明实验中磁珠富集效果良好，泳道1～3分别为(AC)12，(AG)12，(AAC)8探针杂交捕获的 DNA 经PCR扩增后的产物。从约2000个转化子中获得240个阳性克隆。以寡核苷酸链A和探针为引物检测阳性克隆中是否有微卫星序列，如果PCR产物出现2条或2条以上的条带，该克隆内可能含有微卫星插入片段［12］。如图4 所示，泳道 1、2、3、5、7、8、9、10、11、12、13、16、18、19、20、21、24、25、26、28、29 均有可能是含有微卫星片段的阳性克隆。

图3 PCR检测并富集捕获目的片段的电泳图谱Fig.3 Profile of the PCR testing of enriched captured DNA fragments

图4 阳性克隆PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.4 Profile of the PCR amplification of screening for the presence of microsatellite repeats

图5 探针杂交获得克隆的测序结果图Fig.5 Illustration of microsatellite－containing sequences

2.3 测序结果

挑选98个经检验可能含有微卫星重复序列的克隆进行测序。测序获得的豚鼠微卫星特征序列如图5所示。由图5可见，测序峰明确，无杂峰，2碱基重复均大于10次，3碱基重复均大于8次。

2.4 引物设计和扩增

根据测序结果，选择两碱基重复单元的重复次数大于10次，三碱基重复单元的重复次数大于8次的序列用于引物设计。一共设计了35对微卫星引物。经PCR检测后发现，其中17对引物能够稳定地扩增出预期条带。这17对引物的相关信息见表1。

表1 17个豚鼠微卫星位点的相关信息Tab.1 Characteristics of 17 microstellite loci of guniea pig

3 讨论

一个物种微卫星位点的获得一般有两种方法:1)借鉴近缘物种已知的位点信息，即利用微卫星侧翼序列的相对保守性，将近缘物种已知的微卫星引物用于目标物种;2)直接从该物种基因组DNA中筛选。前者快捷方便，但是前提是有相关信息可以借鉴，对于豚鼠这样分类地位较特殊、与大部分模式生物的同源性都较低的物种，这种方法就不合适。直接从物种基因组DNA中筛选微卫星的方法可以应用于任何物种，方法也有很多［13－16］。早期的一些方法费时费力、效率低下［17］。近10年来，出现了许多新的筛选方法:基于 RAPD的 PIMA法［15］，虽然简单快速且只需要使用PCR技术即可实现，但所得克隆的阳性率较低。而基于AFLP技术的筛选方法［16］则过于依赖富集的成效。近年来磁珠富集法被广泛地应用于微卫星筛选研究中［17－19］，其优点在于筛选效率高、阳性克隆率高［20］。本研究选用了磁珠富集法，并在以下步骤进行了优化:(1)限制性内切酶的选择。根据文献资料，本研究最初选取了HaeⅢ，RsaⅠ，AluⅠ，NheⅠ和 SAU3AⅠ五种限制性内切酶进行尝试［21］，结果发现前四种酶作用产生的DNA片段均为平末端。相比于SAU3AⅠ作用产生的粘性末端，平末端DNA片段与接头的连接效率比较低，导致后续步骤中的PCR扩增很难得到理想的结果。经过比较，本研究最终选取了SAU3AⅠ作为唯一的限制性内切酶。(2)杂交后洗脱条件的选择。杂交后的洗脱条件对实验结果至关重要。一方面如果洗脱条件太过严谨(洗脱温度过高、SSC浓度过低)会丢失很多含有微卫星序列的片段;另一方面如果洗脱条件太宽松(洗脱温度过低、SSC浓度过高)则会得到很多无效片段，降低阳性克隆率。

本研究选择磁珠富集法对实验豚鼠进行微卫星筛选，在实验过程中根据物种特点对实验方案进行了优化，获得了一套稳定、高效的筛选方法。通过这一方法成功筛选得到17对豚鼠微卫星位点。这一套分子标记可以用于实验豚鼠遗传分析和多样性鉴定，成为实验豚鼠种群遗传检测和遗传育种的有力工具。

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Microsatellite Enrichment by Magnetic Beads in Guinea Pig(Cavia porcellus)

ZHU Liang，CAI Yue－qin，TU Jue，YING Hua－zhong，XU Jian－qin，CHEN Min－li
(Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China)

Objective To isolate microsatellite loci from guinea pig(Cavia porcellus)genome.Methods The 200～1000 bp DNA fractions of guniea pig containing microsatellite sequences were captured by hybridization with the oligonucleotide probes attached to streptavadin coated magnetic beads.The enriched DNA were ligated into pMD－18T and then transformed into E.coli DH5α competent cells.The method of PCR was used to screen positive clones from the libraries.And microsatellite primers were disigned based on the sequences from the positive clones.Results In total 240 positive clones were identified from about 2000 transformants in the libraries screened by PCR.Finally，we got 98 sequences and successfully designed 17 pairs of microsatellite primers for guniea pig.Conclusions The results showed that this method is very efficient to isolate microsatellite markers and the markers are useful tools for further studies on guinea pig genetics.

Guinea pig;Magnetic beads enrichment;Microsatellite

R394

A

1671－7856(2010)06－0029－06

2010－01－06

浙江省科技厅实验动物公共服务平台项目(2008F80024)。

朱亮(1978－)，女，助理研究员，博士，研究方向:动物分子遗传。E－mail:tozhuliang@126.com