几种天然食用成分对副溶血性弧菌抑菌作用研究

吴伟华，刘承初,*，沈晓盛，赵 勇，李应森，李家乐,4

(1. 上海海洋大学食品学院，上海 201306；2. 中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；3.上海海洋大学 省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306；4. 上海市高校水产养殖学E-研究院，上海 201306 )

几种天然食用成分对副溶血性弧菌抑菌作用研究

吴伟华1，刘承初1,*，沈晓盛2，赵 勇1，李应森3，李家乐3,4

(1. 上海海洋大学食品学院，上海 201306；2. 中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；3.上海海洋大学 省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306；4. 上海市高校水产养殖学E-研究院，上海 201306 )

副溶血性弧菌是引起我国特别是沿海地区细菌性食物中毒危害的首要食源性致病菌。本实验通过单因素试验和正交试验研究醋酸、酒精与茶多酚3种天然食用成分对菌悬液中副溶血性弧菌存活率的影响。单因素试验结果表明：经体积分数高于50%酒精或质量浓度为0.5mg/mL的茶多酚处理5min能完全杀灭菌悬液中的副溶血性弧菌；经pH2的醋酸溶液处理也能使菌悬液中副溶血性弧菌降低4.79lg(CFU/mL)。正交试验结果表明：酒精体积分数、茶多酚质量浓度和酸度对副溶血性弧菌的抑制效果具有明显的协同作用；pH2.8、酒精体积分数20%及茶多酚质量浓度0.125mg/mL或pH2.4、酒精体积分数12%及茶多酚质量浓度0.125mg/mL的混合体系均能有效抑制副溶血性弧菌的生长。这些研究结果说明食用酒精、醋酸和茶叶提取物的适当配合将有可能作为复合杀菌剂用于水产食品中，从而降低副溶血性弧菌感染的风险。

副溶血性弧菌；酒精；醋酸；茶多酚；正交试验

Abstract：Vibrio parahaemolyticusis the most prevalent foodborne pathogen in China, especially in the coastal cities. In this work, the effects of three natural edible components including acetic acid, alcohol and tea polyphenol on the survival rate ofVibrio parahaemolyticusin cultural broth were explored through single factor and orthogonal array experiments.Vibrio parahaemolyticuswas completely inactivated after treatment with 50% alcohol or 0.5 mg/mL tea polyphenol solution for 5 min on the basis of single factor experiments. In addition, bacterial population was reduced by 4.79 lg(CFU/mL) whenVibrio parahaemolyticuscells were treated with acetic acid solution (pH 2) for 0.5 min. The orthogonal array optimization showed that the combined treatment of alcohol, organic acid and tea polyphenol could result in a synergistic inhibitory effect onVibrio parahaemolyticus.Vibrio parahaemolyticuscould be effectively inhibited after treatment with acetic acid solution (pH 2.8)containing 20% alcohol and 0.125 mg/mL tea polyphenol, or acetic acid solution (pH 2.4) containing 12% alcohol and 0.125 mg/mL teapolyphenol. These results suggest that the combined use of alcohol, organic acid and tea polyphenol can offer a compound antibacterial agent for reducing the risk ofVibrio parahaemolyticusinfection during seafood consumption.

Key words：Vibrio parahaemolyticus；alcohol；acetic acid；tea polyphenol；orthogonal design

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌，是我国特别是沿海城市引起食源性疾病的首要致病菌之一[1]。该菌对热敏感，加热到80℃后1min就可将其彻底杀死[2]，一般的烹调方法可起到杀灭作用。然而一些水产品常用于生食，高温处理往往会失去其特有的风味。不经热处理直接生食将大大增加引发食源性疾病的风险性，资料显示2000－2007年上海市由副溶血性弧菌致集体性食物中毒事件起数和涉及患者人数分别占同期食物中毒事件起数和患者人数的57.4%和56.0%，其食物来源多为水产品[3]。因此研究非加热方式对副溶血性弧菌的抑制条件是控制生食海鲜引起食物中毒的关键。

文献显示，酒精饮料、食醋及茶饮料对食源性致病菌如大肠杆菌O157:H7型(Escherichia coliO157:H7)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及肠道致病菌等均具有明显抑菌效果[4-9]。但对副溶血性弧菌这一海产食品头号食源性致病菌的抑菌效果研究甚少见报道，且对致病菌抑菌活性均采用单因素试验研究。本实验在上述文献的基础上，分别通过单因素试验和正交试验研究酒精、茶多酚和醋酸3种天然食用成分对副溶血性弧菌的响应。本实验所选用的几种天然成分均可作为食用调料用于生食海鲜，如醉虾、醉蟹等，主要研究它们对水产品中副溶血性弧菌的协同抑制效果，目的是为开发安全可靠的生食海鲜抑菌调味伴侣提供参考，将由海产食品引发的食源性疾病风险降到最低。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

两株标准菌Vibrio parahaemolyticusATCC33846和Vibrio parahaemolyticusATCC33847由中国科学院微生物研究所菌种中心提供，这两株菌均能产生溶血毒素，是致病性菌株。

茶多酚(茶多酚含量80%，红褐色粉末) 上海诺德生物实业有限公司；无水乙醇(分析纯)、冰醋酸(分析纯)、缓冲蛋白胨水、硫柠胆蔗琼脂、营养琼脂 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 菌悬液制备

将实验菌株分别接种于缓冲蛋白胨水中，在37℃静置培养24h进行菌种的活化。之后转接在硫柠胆蔗琼脂培养基上于37℃静置培养24h。能在该培养基上形成绿色圆形菌落的为副溶血性弧菌，挑取生长旺盛的菌落再次接种于缓冲蛋白胨水中培养16～18h，重复传代3次，收集菌悬液合并，8000r/min离心，弃去上清液，加入10mL灭菌磷酸盐缓冲溶液(pH7.2)，振荡摇匀，待用。菌悬液中副溶血性弧菌的数量采用GB/T 4789.2—2008《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》法计数[10]。

1.3 酒精处理

用无菌生理盐水配制酒精体积分数为0、5%、10%、20%、30%、40%、50%的溶液。各取9mL上述溶液加入无菌试管中，向其中加入1mL副溶血性弧菌菌悬液，充分混匀，处理5min后，使用平板计数法计数。

1.4 醋酸处理

用无菌生理盐水配制pH值分别为6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0的醋酸溶液。各取9mL上述溶液加入无菌试管中，向其中加入1mL副溶血性弧菌菌悬液，充分混匀，处理5min后，使用平板计数法计数。

1.5 茶多酚处理

用无菌生理盐水配制茶多酚质量浓度为0、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1mg/mL的溶液。各取9mL上述溶液加入无菌试管中，向其中加入1mL副溶血性弧菌菌悬液，充分混匀，处理5min后，使用平板计数法计数。

1.6 抑菌正交试验

根据以上单因素试验得到的3组数据，设计三因素四水平正交试验。选用L16(44)正交试验设计表，因素水平如表1，用无菌生理盐水配制4种体积分数酒精，再滴加冰醋酸调节体系pH值，最后加入茶多酚粉末并溶解，保证体系中各物质浓度、pH值与设定的因素水平一致。各体系抑菌方法与单因素试验操作类同。

表1 抑菌正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

2 结果与分析

2.1 不同体积分数酒精对副溶血性弧菌的影响

图1 不同酒精体积分数对菌悬液中副溶血性弧菌作用效果Fig.1 Inhibitory effect of alcohol concentration onV. parahaemolyticus

从图1可以看出，酒精体积分数低于20%时，几乎无抑菌效果；当体积分数在30%～40%时能降低3lg(CFU/mL)～4lg(CFU/mL)副溶血性弧菌；酒精体积分数为50%时，能使7.42 lg(CFU/mL)的副溶血性弧菌在营养琼脂平板上无菌落生长。说明此体积分数对该菌具有明显的杀菌效果。本试验结果表明较低体积分数的酒精(10%～30%)对副溶血性弧菌的抑制效果并不显著。若仅使用酒精进行抑菌，其体积分数需高达50%时才能对菌悬液中的副溶血性弧菌有良好的杀菌效果。

2.2 不同酸度对副溶血性弧菌的影响

图2 不同酸度对菌悬液中副溶血性弧菌作用效果Fig.2 Inhibitory effect of acid concentration onV. parahaemolyticus

从图2可以看出，当pH值高于3时，几乎无抑菌效果；当溶液pH值低于3时，可使副溶血性弧菌含量降低4lg(CFU/mL)以上，说明达到一定浓度的醋酸对副溶血性弧菌有明显的抑制效果。而日常生活中使用的食醋(pH2.4)和果汁等酸性饮料大都能达到这一酸度，因此使用它们能在一定程度上降低副溶血性弧菌引起的食源性疾病风险。

2.3 不同质量浓度茶多酚对副溶血性弧菌的影响

图3 不同质量浓度茶多酚对菌悬液中副溶血性弧菌作用效果Fig.3 Inhibitory effect of tea polyphenol onV. parahaemolyticus

从图3可以看出，当茶多酚质量浓度在0～0.10mg/mL范围内时，茶多酚的抑菌效果不明显；在茶多酚质量浓度＞0.25mg/mL时，抑菌效果增强；当质量浓度＞0.50mg/mL时，副溶血性弧菌基本全部被杀灭。说明茶多酚对副溶血性弧菌具有显著的抑制作用，因此饮茶同样有利于降低副溶血性弧菌引起的食源性疾病风险。

2.4 三因素正交试验结果分析

表2 抑菌正交试验结果与分析Table 2 Orthogonal array design arrangement and experimental results

由表2极值R可知，主要影响因素为酒精体积分数和酸度，其次为茶多酚质量浓度。当3个因素的组合为A3B3C4、A3B4C3和A4B4C4时，能将菌悬液中高达8lg(CFU/mL)的副溶血性弧菌完全杀灭。但实际上食品原料与产品中的副溶血性弧菌含量可能达不到8lg(CFU/mL)，一般为105CFU/mL左右。故在实际应用时，减菌量达到5个数量级就足够了。从表2还可知，组合A3B2C1、A4B2C2、A4B1C1均能使菌悬液中的副溶血性弧菌量降低5个数量级以上，其中以A3B2C1和A4B1C1为佳，即pH2.8、20%酒精、0.125mg/mL茶多酚；pH2.4、12%酒精、0.125mg/mL茶多酚，便能有效抑制副溶血性弧菌的生长，且各抑菌成分浓度较低，有良好的协同效应。

对正交试验结果进行方差分析，并对各因素进行显著性检验，结果如表3所示。通过方差分析及方差齐性检验可知，酸度、酒精体积分数与茶多酚质量浓度对副溶血性弧菌的抑菌效果均为极显著(F0.05＜F＜F0.01)。

表3 抑菌正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis for residual viable count ofV. parahaemolyticus

3 讨 论

单因素试验结果表明，醋酸、酒精和茶多酚对副溶血性弧菌均具有明显的杀灭作用。而这些天然抑菌成分均是食醋、酒类和茶饮料的主要成分，因此食醋、喝酒及饮茶均有降低副溶血性弧菌引起的食源性疾病风险的效果。有研究表明，多种葡萄酒能将菌悬液中的副溶血性弧菌从107CFU/mL降低至少6个数量级至未检出水平[11]；食醋和柠檬酸对副溶血性弧菌有较强的杀灭效果，且效果具有持续性[12-13]；普通绿茶、乌龙茶、普洱茶和红茶的初次水浸液对副溶血性弧菌有较好的抑制作用[14]。这些结果同时也表明醋酸、酒精与茶多酚是对副溶血性弧菌有效的天然抑菌成分。

然而，单因素试验结果表明，这3种抑菌物质的抑制效果与其浓度密切相关。而日常食用时往往需要稀释，这会直接影响到抑菌效果，单纯地依靠其中任何一种均无法达到足够的抑菌效果[15-16]。同时，有研究指出酒的抑菌效果要优于与其度数相同浓度的酒精[11]。而将酒中挥发性物质(主要为酒精)除去后剩下的难挥发性物质(主要为有机酸类)仍有较好的抑菌效果[17]。Sheth等[5]研究也表明含有苹果酸、酒石酸等有机酸的低度酒(pH 3.5，酒精体积分数10%)可以使得副溶血性弧菌含量下降3～6个数量级。这说明将几种有抑菌效果的食用成分复合使用，可以增强抑菌效果，从本实验结果可知，它们之间的协同抑菌效果是很明显的，能在降低各组分实际浓度的同时保持较好的抑菌效果。

以上研究结果说明食用酒、醋和茶叶提取物的适当配合将有可能作为复合杀菌剂用于水产食品中，特别地将它们应用于醉虾、醉蟹类生食海鲜既可作为抑菌剂提高食用安全性，同时又可作为调味剂改善其风味。

[1] SU Yicheng, LIU Chengchu.Vibrio parahaemolyticus:A concern of seafood safety[J]. Food Microbiology, 2007, 24(6):549-558.

[2] 王玉祥, 刘培生, 李金梅, 等. 不同烹调方法对副溶血性弧菌杀灭效果的初步研究[J]. 中华预防医学杂志, 1982, 16(3):169-170.

[3] 田明胜, 郑雷军, 彭少杰, 等. 2000－2007年上海市副溶血性弧菌致集体性食物中毒分析及对策[J]. 中国食品卫生杂志, 2008, 20(6):514-517.

[4] MORETRO T, DAESCHEL M A. Wine is bactericidal to food-borne pathogens[J]. Food Science, 2004, 69(9):251-257.

[5] SHETH N K, WISNIEWSKI T R, FRANSON T R. Survival of enteric pathogens in common beverages:anin vitrostudy[J]. American Journal of Gastroenterology, 1988, 83(6):658-660.

[6] WEISSE M E, EBERLY B, PERSON D A. Wine as a digestive aid:comparative antimicrobial effects of bismuth salicylate and red and white wine[J]. British Medical Journal, 1995, 311(7021):1657-1660.

[7] 王玉春. 茶多酚的提取方法及应用研究进展[J]. 甘肃联合大学学报,2008, 22(3):22-27.

[8] 董金莆, 李瑶卿, 洪绍梅. 茶多酚(TPP)对8种致病菌最低抑制浓度的研究[J]. 食品科学, 1995, 16(1):6-12.

[9] 葛新, 刘丽英, 刘海玲, 等. 食醋对肠道杆菌抑菌作用的观察[J]. 实用预防科学, 2005, 1(12):181-182.

[10] GB/T4789.2－2003 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定[S]. 北京:中国标准化出版社, 2003.

[11] LIU Chengchu, CHEN Ruiying, SU Yicheng. Bactericidal effects of wine onVibrio parahaemolyticusin oysters [J]. Journal of Food Protection, 2006, 69(8):1823-1828.

[12] 石玉新, 马艳丽, 齐树亭. 柠檬酸对三种常见水产病原菌的抑菌作用[J]. 饲料工业, 2005, 2(6):57-59.

[13] ENTANI E, ASAI M, TSUJIHATA S, et al. Antibacterial action of vinegar against food-borne pathogenic bacteria includingEscherichia coliO157:H7 [J]. Food Protection, 1998, 61(8):953-959.

[14] 鲁晓晴, 张超英, 王斌. 茶叶水浸液对肠道致病菌抑菌作用的研究[J]. 中华医院感染学杂志, 2009, 19(5):532-533.

[15] Centers for Disease Control. Outbreak ofSalmonellaSerotypeMuenchen infectionsassociated with unpasteurized orange juice: United States and Canada[R]. Canada:USCDC, 1999.

[16] Food and Drug Administration. Food labeling:warning and notice statement; labeling of juice products[R]. USA:USFDA, 1998.

[17] JUST J R, DAESCHEL M A. Antimicrobial effects of wine onEscherichia coliO157:H7 andSalmonella typhimuriumin a model stomach system[J]. Food Science, 2003, 68(1):285-290.

Inhibitory Effects of Natural Edible Components onVibrio parahaemolyticus

WU Wei-hua1，LIU Cheng-chu1,*，SHEN Xiao-sheng2，ZHAO Yong1，LI Ying-sen3，LI Jia-le3,4
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China；3. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306, China；4. Aquaculture Division, E-Institute of Shanghai Universities, Shanghai 201306, China)

R187. 2

A

1002-6630(2010)21-0289-04

2010-06-30

上海高校创新团队建设项目；上海市教育委员会科研创新重点项目(09ZZ166)；上海市教育委员会重点学科建设项目(J50704)

吴伟华(1985—)，男，硕士研究生，主要从事营养与食品安全研究。E-mail：wuweihua0@yahoo.cn

*通信作者：刘承初(1965—)，女，教授，博士，主要从事海洋生物资源利用、营养与食品安全研究。E-mail：ccliu@shou.edu.cn