高效液相色谱法测定南瓜中β-胡萝卜素和VE的含量*

田密霞，胡文忠，霍晓雪，王艳颖，姜爱丽，刘程惠，范圣第

(大连民族学院生命科学学院生物技术与资源利用国家民委—教育部重点实验室，辽宁大连，116600)

高效液相色谱法测定南瓜中β-胡萝卜素和VE的含量*

田密霞，胡文忠，霍晓雪，王艳颖，姜爱丽，刘程惠，范圣第

(大连民族学院生命科学学院生物技术与资源利用国家民委—教育部重点实验室，辽宁大连，116600)

采用高效液相色谱法同时测定新鲜南瓜与经冷冻干燥处理后南瓜中β-胡萝卜素和VE的含量。结果表明:β-胡萝卜素浓度在1～6μg/mL内线性关系良好，VE的浓度在0.375～2.25μg/mL内线性关系良好。南瓜鲜肉中β-胡萝卜素和VE的平均回收率分别为100.78%(RSD=0.12%)和99.75%(RSD=0.3%)，南瓜鲜皮中β-胡萝卜素和VE的平均回收率分别为100.43%(RSD=0.27%)和99.25%(RSD=0.16%)，而在冻干南瓜肉中β-胡萝卜素和VE的平均回收率分别为100.62%(RSD=0.44%)和99.71%(RSD=0.15%)，在冻干南瓜皮中β-胡萝卜素和VE的平均回收率分别为100.11%(RSD=0.13%)和99.75%(RSD=0.07%)。

南瓜，β-胡萝卜素，VE，高效液相色谱

南瓜营养丰富且全面，含人体全部必需氨基酸、多糖、果胶及矿物质，而且南瓜中富含大量的β-胡萝卜素和丰富的维生素［1－2］。吴增茹［3］等人测定了不同品种南瓜中β-胡萝卜素的含量，但很少有报道采用HPLC法测定南瓜中VE的含量。本实验在比较了赵文恩等［4－6］人的方法后，并加以改进，采用高效液相色谱(HPLC)法，同时测定市售南瓜肉和南瓜皮中β-胡萝卜素和VE的含量，节省了大量的资金和时间，以期为南瓜的日后的进一步开发提供一定的依据。

1 材料和方法

1.1 主要仪器设备

高效液相色谱仪:日本鸟津，二极管阵列检测器，柱前加预柱保护;Labda-250型紫外可见分光光度计:美国PE;电子天平:上海 梅特勒-托利多;微型细胞破碎仪:USA SONICS VC×130;粉碎机:广州。

1.2 实验试剂与材料

1.2.1 试剂

分析纯三氯甲烷:沈阳市华东试剂厂;色谱纯甲醇:德国默克;水为经纯水装置进行去离子后的双蒸水，之后进行微孔滤膜过滤得到后备用;标准β-胡萝卜素:Sigma Fluka;VE:USA SUPELCO。

1.2.2 材料

鲜南瓜采购于大连开发区乐购超市，其成熟度、大小、颜色、形状一致，无病虫害。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

(1)冻干皮:取鲜南瓜不同部位的表皮，切碎、混匀，称取约100 g真空冷冻干燥，冻干样品磨碎，过40目筛，干粉至于样品瓶中，在干燥器中避光保存。

精确称取干粉样品0.2g，加入5mL三氯甲烷，用细胞破碎器2 s+3 s破碎3 min。用移液枪取下面的清液1mL于10mL棕色容量瓶中，再用甲醇定容。经0.45 μm微孔有机滤膜过滤后，外标法进行HPLC分析，全部操作均在避光下进行。

(2)鲜皮:取南瓜不同部位的表皮，切碎，混匀，称取1.0 g加入15mL三氯甲烷，匀浆，离心(4℃，6 000 r/min，5 min)，用移液枪取上清液1mL于10mL棕色容量瓶中，再用甲醇定容。经0.45μm微孔滤膜过滤后，外标法进行HPLC分析，全部操作均在避光下进行。

(3)取0.4 g冻干肉(其他步骤及试剂用量同冻干皮)和取3 g鲜肉(其他步骤及试剂用量同鲜皮)分别测定南瓜冻干肉和鲜肉中β-胡萝卜素和VE的含量。

1.3.2 标准溶液的制备

取2.5μgβ-胡萝卜素标准品(Sigma)用5mL 三氯甲烷溶解，转移到50mL棕色容量瓶中，再用甲醇定容。

取1.9μgVE标准品用10mL三氯甲烷溶解，转移到100mL棕色容量瓶中，再用甲醇定容。

1.3.3 最佳检测波长的确定

使用Labda-250型紫外可见分光光度计在190～500 nm，对南瓜样品溶液进行光谱扫描，选取流动相中β-胡萝卜素和VE的最大吸收波长作为检测波长。

1.3.4 色谱分析条件色谱柱

Hypersil ODS C18(4.6 mm ×250 mm i.d.5μm);流动相:甲醇;检测器:DIODE ARRAY DET-ECTOR;进样法:手动进样，进样体积20μL。

1.3.5 标准曲线的绘制

分别取等量的β-胡萝卜素和VE标准样50、100、150、200、250、300 μ L 于 10mL 棕色容量瓶中，稀释成梯度浓度(表1)，经0.45 μm微孔滤膜过滤后，在1.3.4色谱条件下检测，每种浓度重复进样5次，以质量浓度为横坐标，平均峰面积为纵坐标绘制标准曲线(分析过程中，未分析标准液于5℃冷藏备用)。

表1 β-胡萝卜素和VE标准液浓度

1.3.6 样品的测定

取南瓜样品按照1.3.1方法制备供试液，按照1.3.4色谱条件进行检测，重复进样5次，记录峰面积，取平均值，利用标准曲线计算各样品中β-胡萝卜素和VE的含量。

2 结果与分析

2.1 吸收波长的选择

使用Labda-250型紫外可见分光光度计在(190～500)nm波长内，在对南瓜对照品溶液进行光谱扫描。扫描结果表明，流动相中南瓜样品中VE最大吸收波长为 292nm，β-胡萝卜素最大吸收波长为450nm。

2.2 标准曲线绘制

图1，图2表明，进样 20μL，南瓜中 β-胡萝卜素在1～6μg/mL同时VE质量在0.375～2.25μg范围内，峰面积与质量浓度有很好的线性关系。β-胡萝卜素回归方程为y=110.7x-31.684，R2=0.999 5;VE回归方程为y=110.7x-31.684，R2=0.999 5。图3，图4分别为β－胡萝卜素标准样品和VE标准样品色谱图，β-胡萝卜素出峰时间为35.531min，VE出峰时间9.016min。

图1 β-胡萝卜素含量测定的工作曲线

图2 VE含量测定的工作曲线

图3 β-胡萝卜素标准样品色谱图

图4 VE标准样品色谱图

2.3 不同提取溶剂的比较

按1.3.1方法V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=10∶90、V(甲醇)∶V(正己烷)=80∶20、三氯甲烷3种溶剂进行试验(平行3组)，结果表明，三氯甲烷作为提取剂β-胡萝卜素出峰不明显，V(甲醇)∶V(正己烷)=80∶20作为提取剂杂峰较多，而甲醇作为提取剂β-胡萝卜素和VE在出峰时间上不冲突且各自出峰均较明显，因而最终选择V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=10∶90作为提取剂。

2.4 样品的定量分析

2.4.1 β-胡萝卜素的定量分析

对于β-胡萝卜素的定量分析，本文采用标准β-胡萝卜素的三氯甲烷-醇溶液做外标，利用β-胡萝卜素的标准曲线求出样品中β-胡萝卜素响应峰的相应浓度，从而求出样品中β-胡萝卜素的含量，结果如表3所示。从表3中可知，冻干南瓜皮中含有极其丰富的β-胡萝卜素，达789.86μg/g，而经过冷冻干燥处理的南瓜肉中 β-胡萝卜素的含量则明显减少，只有176.73μg/g，这一发现希望对今后南瓜皮的进一步开发提供一定的依据。

表3 β-胡萝卜素的定量分析结果

2.4.2 VE的定量分析

对于VE的定量分析，本文同对β-胡萝卜素的定量分析采用了相同的方法。结果显示(表4)，鲜南瓜肉中VE的含量最多，达265.66μg/g，经过冷冻干燥处理后的南瓜中，无论是皮还是肉中VE的含量明显较少，这可能与VE较敏感，易氧化有关系，与空气中的氧化剂、紫外线接触越长时间，氧化越明显［9］。

表4 VE的定量分析结果

2.5 方法精密度实验

从表5的数据可以看出每一个RSD值均在允许误差范围内，实验精密度良好，实验数据可靠。

2.6 稳定性试验

由于每次进样间隔是1 h，并且所配溶液在低温、避光保存，溶液性质较稳定，故可依据2.5精密度实验来分析本次实验的稳定性。显然，由表5可以看出，本次试验结果稳定性较好，只要注意保存条件(低温、避光、密封)即可较长时间保持其性质不改变。

表5 方法精密度实验结果

2.7 加标回收率实验

精确吸取5份已知浓度(β-胡萝卜素6.318 9μg/mL和VE1.423 2μg/mL)的冻干南瓜皮试液各1mL，分别加入1mL各混合标准溶液，再定容到10mL，按1.3.4色谱条件下进行检测，测定峰面积，计算样品平均回收率及相对标准偏差(RSD)。每个样品测定5次。

GE 6只以冻干南瓜皮中的β-胡萝卜素加标回收率实验结果为例。

表6 冻干南瓜皮β-胡萝卜素加标回收率实验结果(n=5) C0=0.63μg/mL

从表6可以看出，在实验过程中，实验数据精密度和加标回收率都比较符合要求，实验结果可信。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

通过对南瓜混合标准品(对照组)的光谱扫描图(图1)可以看出，南瓜β-胡萝卜素在450nm处有最大吸收，VE在292nm处有最大吸收，故选择450nm进行计算分析南瓜β-胡萝卜素含量，选择292nm处的色谱图进行计算分析南瓜VE含量。

3.2 流动相的选择

实验过程中曾用以下种流动相:V(甲醇)∶V(正己烷)=90∶10;V(甲醇)∶V(正己烷)=80∶20;V(甲醇)∶V(水)=80∶10;V(甲醇)∶V(水)=80∶20;纯甲醇相。实验发现，甲醇与其他溶剂结合的流动相分离效果都不理想，只有使用纯甲醇作为流动相时，β-胡萝卜素和维生素分离效果好。

3.3 样品含量的测定

由南瓜β-胡萝卜素和VE混合标准品的色谱图可以看出β-胡萝卜素的保留时间为35.531min左右，VE的保留时间为9.016min左右。由于β-胡萝卜素和VE的吸收峰附近极少出现杂峰，故使用外标法即可。

4 结论

本文建立了同时测定南瓜中的β-胡萝卜素和VE的液相色谱方法。采用甲醇为流动相，能将β-胡萝卜素和VE很好的分离。南瓜鲜肉中β-胡萝卜素和VE的平均回收率分别为100.78%(RSD=0.12%)和99.75%(RSD=0.3%)，南瓜鲜皮中 β-胡萝卜素和VE的平均回收率分别为100.43%(RSD=0.27%)和99.25%(RSD=0.16%)，而在冻干南瓜肉中β-胡萝卜素和VE的平均回收率分别为100.62%(RSD=0.44%)和99.71%(RSD=0.15%)，在冻干南瓜皮中β-胡萝卜素和VE的平均回收率分别为100.11%(RSD=0.13%)和99.75%(RSD=0.07%)。回收率较高。

前处理方法采用加入溶剂三氯甲烷后，用细胞破碎器2s+3s破碎3min。若样品的分离度不好再离心后，取清液1mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容。经0.45μm微孔有机滤膜过滤后，外标法进行HPLC分析，全部操作均在避光下进行。该处理方法操作简单，而且时间短，既有效地减少了处理过程中β-胡萝卜素和VE的损失，又提高了检测的准确性。为以后同时分析同时其他样品中的β-胡萝卜素和VE奠定了一定的基础。

［1］Yong-Kong-Park，Hwan-Soo-Cha，Mee-Weon-Park，et al.Chemical components in different parts of pumpkin［J］.Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition，1997，26(4):639－646.

［2］Gyu-Seong Cho.Chemical composition of the green and ripened pumpkin(Cucurbita moschata Duch.)［J］.Korean Journal of Food Science and Technology，1997，29(4):657－662.

［3］吴增茹，金同铭.用高效液相色谱法测定不同品种南瓜中的 β-胡萝卜素的含量［J］.华北农学报，1998，13(3):141－144.

［4］赵文恩，张劲强，乔宪生，等.高效液相色谱法测定苹果果皮的类胡萝卜素［J］.果树学报，2001，18(2):95－97.

［5］李静娜，朱其明，肖永华.二极管阵列反向高效液相色谱法测定人血清中VE的含量［M］.中国卫生检验杂志，2008.18(2):259－260.

［6］Katrangi N，Kaplan L A，Stein E A.Separation and quantitation of serumβ-carotene and other carotenoids by high performance liquid chromatography［J］.Journal of Lipid Research，1984，25:400－406.

［7］曹红翠.反向高效液相色谱法测定VE中α—E含量［J〛.光谱实验室，2009，26(2):351－353.

Method of HPLC to Determine β-Carotene and VEcontent in Pumpkin

Tian Mi-xia，HuWen-zhong，Huo Xiao-xue，Wang Yan-ying，Jiang Ai-li，Liu Cheng-hui，Fan Sheng-di
( Key Laboratory of Biotechnology ＆ Bioresources Utilization，The State Ethnic Affairs Commission -Ministryf Education，College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China)

Using HPLC method determine the content of β-carotene and VEin fresh pumpkin and pumpkin by freeze-drying treatment in the same time.The results showed that the calibration curve was good linear regression in the range of(1～6)μg/mL for β-carotene and(0.375～2.25)μg/mL for VE.In fresh pumpkin pulp，the average recoveries of β-carotene and VEare 100.78%(RSD=0.12%)and 99.75%(RSD=0.3%).In fresh pumpkin peel，the average recoveries of β-carotene and VEare 100.43%(RSD=0.27%)and 99.25%(RSD=0.16%)respectively.But in pumpkin by freeze-drying pulp the average recoveries of β-carotene and VEare 100.62%(RSD=0.44%)and 99.71%(RSD=0.15%)respectively.In pumpkin by freeze-drying peel，the average recoveries of βcarotene and VEare 100.11%(RSD=0.13%)and 99.75%(RSD=0.07%)respectively.The method is simple，high precision and good repeatability，and provides a reliable scientific basis for pumpkin in determining β-carotene and VE in the same time.

pumpkin，β－carotene，VE，HPLC

硕士，工程师(胡文忠教授为通讯作者)。

*国家自然科学基金资助(30771508，20972038)资助

2010－05－27，改回日期:2010－09－24