二次通用旋转组合设计优化茶皂素的提取工艺*

聂芸，周倩，屈晓清，李晋丽，丁之恩

(安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥，230036)

二次通用旋转组合设计优化茶皂素的提取工艺*

聂芸，周倩，屈晓清，李晋丽，丁之恩

(安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥，230036)

以油茶饼为原料，甲醇为提取剂，采用二次通用旋转组合设计试验，对超声波辅助提取工艺进行优化，在单因素基础上，选定料液比、提取温度和提取时间为试验因素，以茶皂素提取效率为目标建立回归数学模型，通过对试验结果进行方差分析及对数学模型进行优化得到茶皂素的优化提取条件。试验结果表明:料液比1∶9(g∶mL)、超声温度50℃、超声提取时间57 min为超声波辅助提取茶皂素的最佳工艺条件，此条件下茶皂素提取效率可达到80.89%。

茶皂素，二次通用旋转组合设计，超声辅助提取

茶皂素(tea saponin)，又称茶皂苷、茶皂苷、皂角苷，是一种五环三萜类皂苷化合物，大量存在于油茶饼中。茶皂素是一种天然非离子型表面活性剂［1］，在分散、湿润、发泡、去污等方面具有良好的活性［2－3］，并具有抗炎、抗渗透、祛痰、止咳、镇痛、杀菌、杀虫及促进植物生长等多种生理功效［4－5］，因此在工业、农业、医药、食品等领域有着广泛的应用［6～10］。

二次通用旋转组合设计是正交回归组合设计的一种，具有旋转性，能够克服回归正交设计中二次回归预测值的方差依赖于试验点在因子空间中位置的缺点，有利于得到较优的提取工艺条件［11－12］。

茶皂素的传统提取方法主要是浸提法，如水提法，有机溶剂浸提法［13－14］。随着工艺的改进，又有了超声波辅助提取法［15－16］，微波辅助提取法［17－18］等。由于茶皂素易溶于甲醇，而甲醇沸点较低，且易回收，因此本文采用甲醇作为提取剂，利用超声波辅助提取，并结合二次通用旋转组合设计实验方法，建立了以茶皂素提取效率为目标函数的数学模型，并研究了料液比、提取时间和提取温度之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶饼:经野生油茶籽压榨油后得到，由安徽舒城县夏凡茶油厂提供;石油醚、甲醇、正丁醇、香草醛、浓硫酸、无水乙醇:均为分析纯;茶皂素对照品:天津一方科技有限公司。

1.2 主要仪器

T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司;HITACHI SCT 15B型离心机，日本日立公司;真空干燥箱，上海实验仪器总厂;RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;DFT-100多功能中药粉碎机，温岭市大德中药机械有限公司;FA2104万分之一电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司;KQ3200DE型数控超声波提取器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

原料经干燥粉碎后，用石油醚加热回流，过滤后挥干滤渣中的石油醚，得到脱脂的油茶饼粕。

1.3.2 茶皂素样液的制备

精确称取脱脂茶饼粉若干份，每份5.000 0 g，加入一定体积甲醇按不同的试验设计条件进行超声波辅助提取，挥干溶剂后加水溶解，用水饱和的正丁醇萃取，萃取液减压浓缩至干，用甲醇定容到50mL容量瓶，待测。

1.3.3 紫外分光光度法测定茶皂素含量［19］

用甲醇将茶皂素对照品制备成1mg/mL对照品溶液，分别取对照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，置于具塞试管中，并加甲醇至溶液体积为0.5mL，准确加入80g/L香草醛溶液0.5mL，于冰水浴中加入77%硫酸溶液4mL，摇匀，于60℃加热15 min，取出，冰水浴冷却。以试剂为空白，于波长为550 nm下测定吸光值，以吸光度为纵坐标(Y)、茶皂素质量浓度(X)为横坐标制作标准曲线，线性回归方程为:Y=1.089 5X－0.123 5，R2=0.996 3。

1.3.4 原料茶饼中茶皂素的测定

精确称取2.500 0 g的脱脂茶饼粉末，滤纸包好置于索氏抽提器中，用甲醇回流提取3 h，直至回流液呈无色，提取液经浓缩、水饱和正丁醇萃取后，用甲醇定容，按1.3.3中方法测定原料茶饼中茶皂素含量。

1.3.5 超声波辅助提取法的单因素和二次通用旋转组合试验

以甲醇为提取剂，采用超声波辅助提取，对料液比、超声作用时间和提取温度等因素进行单因素实验。实验重复3次，取其平均值。在单因素实验的基础上，设计3因素3水平的二次通用旋转实验，以茶皂素提取效率为考核指标，确定最优提取方案和工艺参数。

1.4 统计分析

二次通用旋转正交组合设计的试验结果分析均在DPS数据处理软件上运行。

2 结果与分析

2.1 料液比对茶皂素提取效率的影响

准确称取5份5.000 0 g油茶饼粕，分别按料液比(g∶mL)1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 于 40℃超声提取30 min，料液比对茶皂素提取效率的影响如图1。

图1 料液比对茶皂素提取效率的影响

从图1中可以看出，随着浸提液料比的增加，茶皂素提取效率增加，在料液比达到1∶8左右时，再增加料液比提取效率基本不变。因此，选用1∶8的料液较为合适。

2.2 提取时间对茶皂素提取效率的影响

准确称取5份5.000 0 g油茶饼粕，料液比为1∶8，分别于 40℃超声提取 30、40、50、60、70 min，浸提时间对茶皂素提取效率的影响结果如图2。

图2 提取时间对提取效率的影响

从图2可以看出，超声时间愈长，茶皂素提取效率愈高，在超声50 min左右时，再延长提取时间，茶皂素提取效率增长趋缓，因此选取超声时间50 min为宜。

2.3 提取温度对茶皂素提取效率的影响

准确称取五份5.000 0 g油茶饼粕，料液比为1∶8，分别于 30、40、50、60、70℃ 的条件下超声提取 50 min，浸提温度对茶皂素提取效率的影响如图3。

图3 温度对茶皂素提取效率的影响

从图3可看出，随着温度的升高，茶皂素的提取效率也随之提高，但到70℃时提取效率降低，主要原因是此时温度已超过甲醇沸点，甲醇挥发比较严重，因此选择50℃左右为宜。

2.4 二次通用旋转组合试验

根据单因素试验结果，以对茶皂素提取影响较大的料液比(X1)、提取温度(X2)、提取时间(X3)为3个试验因素，以茶皂素提取效率为目标，设计3因素3水平的二次通用旋转组合试验设计，用以优化茶皂素的提取条件，确定料液比(X1)、提取温度(X2)、提取时间(X3)的零水平分别为 1∶8、50℃ 、50 min，试验设计及结果如表1和表2

表1 因素水平表

表2 二次通用旋转组合设计试验方案及结果

表3 试验结果方差分析

由料液比、提取温度、提取时间等3个因素对茶皂素提取效率相互作用所得结果见表3。同时，根据多项式回归方程Y=b0+∑biXi+∑bijXiXj+∑Xii2，按试验结果计算出拟合方程的各项系数，从而得到回归方程:Y=78.105 06+4.355 21X1+1.122 14X2+6.726 60X3－2.770 03X12－3.049 33－4.053 43－0.248 75X1X2－1.908 75X1X3－1.181 25X2X3

表3为试验结果的方差分析，由表3可知，回归方程显著性检验 F2=10.549 81＞F0.01(9，10)=4.94，回归显著，说明该方程与实际情况拟合很好;失拟性检验F1=3.244 77＜F0.05(5，5)=5.05，说明未知因素对实验结果干扰很小，回归模型与实测值能较好地拟合。单因素中，仅温度(X2)不显著，其他几个因素的分析均达到了显著水平;剔出α=0.10的不显著项后，建立提取率对试验因子的回归方程:

2.4.1 单因素分析

根据试验结果对单因素进行效应分析，结果见表4及图4。

表4 单因素效应分析

图4 各单因素与茶皂素提取效率的关系

由表4和图4可以看出，提取时间对茶皂素提取效率影响最大，其次是料液比，提取温度对茶皂素提取效率影响最小。随着提取时间的增加，茶皂素的提取效率也随之增加，当提取时间的试验水平为1.000 0时，即提取60 min，茶皂素的提取效率达到最高。再延长时间，茶皂素提取效率趋缓甚至略有下降，这是因为达到一定时间后，液相主体溶质浓度增加，传质动力减小，浸提速度下降，最终达到平衡状态，再延长提取时间茶皂素的提取效率增长十分缓慢。

料液比对茶皂素提取效率的影响在试验水平1.000 0时达到最高，此时料液比为1∶9。茶皂素的提取过程，即为茶皂素的溶出过程，理论上讲，料液比越大，则液相主体的溶质浓度低，传质推动动力越大，浸取速度增加，但是料液比增大，溶剂的用量加大，使溶剂回收或浓缩溶液的工作量加大，同时溶出的其他杂质的机会也越多，因此要选择合适的料液比。

随着提取温度的增加，茶皂素的提取效率逐渐增大，当提取温度的试验水平为0.000 0时，即温度达到50℃时，茶皂素的提取效率达到最高。而后温度再升高时，茶皂素提取效率则逐渐降低，主要原因是甲醇挥发比较严重，提取液颜色加深，同时，温度升高，溶液黏性增加，淀粉糊化速度加快，阻止了茶皂素的析出。

2.4.2 交互作用效应分析

选取一个因素固定于零水平，考察另两个因素的交互作用，分别作图可以直观地分析各因子间的互作效应，结果分别见图5～图7。

图5 料液比(X1)与温度(X2)的交互作用图

图6 料液比(X1)与时间(X3)的交互作用图

图7 温度(X2)与时间(X3)的交互作用图

图5为料液比(X1)与温度(X2)的交互作用图，由图5可知，在一定的提取浓度(X1)下，茶皂素的提取效率随着温度的增大而升高，当达到最大值后，温度(X3)的增加只会降茶皂素的提取效率，亦即温度(X3)不宜过高，温度(X3)过高甲醇易挥发，降低茶皂素的提取效率。同理，在一定的温度(X3)下，料液比(X1)的增加也会提高茶皂素的提取效率，随着料液比(X1)的增加，茶皂素的提取效率增长趋于平缓。

图6为料液比(X1)与时间(X3)的交互作用图，由图可知，提取时间(X3)在较高水平时，茶皂素的提取效率都比较高，而提取时间(X3)在较低水平时，茶皂素的提取效率虽然会随着料液比(X1)的增加而增加，但与提取时间(X3)在高水平相比，仍然较低。在料液比(X1)一定的情况下，茶皂素的提取效率会随着提取时间(X3)的延长有明显提高，但延长时间过长，茶皂素提取效率反而略有下降，说明提取时间(X3)对茶皂素的提取效率有很大影响。

图7为温度(X2)与时间(X3)的交互作用图，由图可知，在提取时间(X3)一定时，将提取温度(X2)增加即可提高茶皂素的提取效率，但到达最高之后，茶皂素的提取效率会随着温度(X2)的升高而降低，而且在不同时间(X3)时，其变化趋势是不同的，当时间(X3)较短时，尽管随着温度(X2)的升高会增大茶皂素提取效率，但是变化较缓;而当提取时间(X3)逐渐延长，茶皂素提取效率随提取温度(X2)变化较为明显;两者的相互影响表明，选取适宜的提取温度(X2)和时间(X3)可使茶皂素有较高提取效率。

2.5 提取工艺的优化

由试验结果分析可知，在试验中不但存在着单因素效应，而且还有因素间的交互作用，因此很难从单因素效应和交互作用的结果分析中找到最佳提取条件，并且三元二次回归的数学模型不存在提取效率函数的极值，同时考虑到本试验中温度不宜太高、时间不宜太长等因素，因此需对回归模型进行再解析，本试验采用频率分析法分析回归模型以找到最佳提取条件，结果见表5。

由表5可知，在95%的置信区间茶皂素提取效率大于71.36%各变量的取值区间分别为0.585～1.091、－0.341～0.341、0.708～1.123，即料液比为1∶8.6～1∶9.1、温度为48.3～51.7℃、提取时间为57～61.2 min，在此范围内，考虑到实际的可操作性，可将最佳工艺条件定为:料液比为1∶9、温度为50℃、提取时间为57 min，在此条件下预测值为81.08%，用此最优提取条件对其进行验证，得茶皂素提取效率为80.89%，与预测值较为接近，表明本试验结果拟合得出的回归方程可以较好地应用于茶皂素的提取。

表5 各变量取值的频率分布

3 结论

(1)采用二次通用旋转组合设计，以油茶饼为原料提取茶皂素，以影响茶皂素提取效率的料液比(X1)、提取温度(X2)、提取时间(X3)几个因素为试验因素设计安排试验，得到了三元二次数学回归模型:Y=78.105 06+4.355 21X1+6.726 60X3－2.770 03－3.049 33－4.053 43。

(2)对数学模型进行优化可知，茶皂素提取效率大于71.36%的最优提取条件为料液比1∶8.6～1∶9.1、温度48.3～51.7℃、提取时间57～61.2 min，在此范围内，考虑到实际的可操作性，可将最佳工艺条件定为:料液比为1∶9、温度为50℃、提取时间为57 min，此条件下茶皂素的实际提取效率为80.89%，与预测值81.08%较为接近，说明数学模型对茶皂素的提取工艺是可行的。

［1］李升锋，尹国，刘学铭，等.茶皂素性质提取、精制及应用［J］.粮食与油脂，2003(11):17－18.

［2］李运涛，贾斌.茶皂素的提取工艺及其在洗涤剂中的应用［J］.茶叶科学，2006，26(3):199－203.

［3］胡绍海，胡卫军.茶皂素在化学农药乳油剂中增效作用研究［J］.中国农业科学，1998(2):36－40.

［4］柳荣祥等.茶皂素生物活性应用研究进展及发展趋势［J］. 茶叶科学，1996，16(2):81－86.

［5］黄卫文，敖常伟.油茶皂素抑菌研究［J］.经济林研究，2002，20(1):17－19.

［6］浦炳寅.茶皂素生产工艺及其应用的研究进展［J］.天然产物研究与开发，1999，11(5):55－59.

［7］胡绍海，胡卫东.茶皂素在农药领域的应用研究［J］.中国油脂，1997，22(4):61－62.

［8］Mao H L，Wang J K，Zhou Y Y，et al.Effects of addition of tea saponins and soybean oil on methane production，fermentation and microbial population in the rumen of growing lambs［J］.Livestock Science，2010，129(1):56－62.

［9］Xia H L，Chi X Y，Yan Z J，et al.Enhancing plant uptake of polychlorinated biphenyls and cadmium using tea saponin［J］.Bioresource Technology，2009，100(20):4 649－4 653.

［10］Hu W L，Wu Y M，Liu J X，et al.Tea saponins affect in vitro fermentation and methanogenesis in faunated and defaunated rumen fluid［J］.Journal of Zhejiang University Science，2005，6B(8):787－792.

［11］杨德.试验设计与分析［M］.北京:中国农业出版社，2002.

［12］赖富饶，吴晖.二次通用旋转组合设计优化豆皮水溶性多糖的提取工艺［J］.现代食品科技，2008，24(12):1 259－1 263.

［13］张可，钱和，张添，等.油茶饼粕中茶皂素提取工艺的研究［J］.食品科技，2003(10):68－70.

［14］钱仁渊，陈德军，包宗宏.甲醇－6号溶剂-水混合溶剂浸提油茶籽油的研究［J］.中国油脂，2005，30(10):36－38.

［15］刘昌盛，黄凤洪.超声波法提取茶皂素的工艺研究［J］.中国油料作物学报，2006，28(2):203－206.

［16］李静，李燕.茶皂素的提取及纯化研究［J］.食品科学，2008，29(11):154－156.

［17］吴雪辉，张喜梅.茶皂素微波提取过程的优化及数学描述［J］.华南理工大学学报，2009，37(4):125－129.

［18］郭辉力，邓泽元.微波/光波辅助提取茶皂素的研究［J］.食品工业科技，2008(11):168－170.

［19］侯如燕，宛晓春，黄继轸.油茶皂苷标准品的制备及定量方法的比较［J］.食品与发酵工业，2005，31(8):62－65.

Optimization of the Extraction Process of Tea Saponin by Quadratic General Rotary Unitized Design

Nie Yun，Zhou Qian，Qu Xiao-qing，Li Ging-li，Ding Zhi-en
(College of Tea and Food Science Technology，Hefei 230036，China)

Based on the cake of camellia oleifera seeds as raw materials，the methanol as extraction agents，use quadratic general rotary unitized experimental design to optimize the process of ultrasonic-assisted extraction.Based on the single factor，solid-liquid ratio，extracting temperature and the time were selected as the test elements.The regression mathematics model with extraction efficiency of tea saponin as the target was established.The optimization extraction conditions was achieved through the results of variance analysis and mathematical model optimization.The results showed that the best condition for the ultrasonic-assisted extraction of the tea saponin is:solid-liquid ratio 1∶9，temperature 50℃，extracting for 57mins.Under this condition，the tea saponin extraction efficiency can reach to 80.89%.

tea saponin，quadratic general rotary unitized design，ultrasonic-assisted extraction

硕士研究生(丁之恩教授为通讯作者，E-mail:dingze@zhau.edu.cn)

*科技部“部分食用植物油脂加工关键技术及资源综合利用”项目(2009GJC30030)

2010－08－11，改回日期:2010－10－20