圆山药的离体培养

金 密，彭晓英，周双德，彭尽晖，李 英

(湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

圆山药的离体培养

金 密，彭晓英*，周双德，彭尽晖，李 英

(湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

为建立圆山药的离体培养体系，将野生苗盆栽后，切取其嫩叶、茎段、地下块茎和不定根作为外植体，探讨不同消毒方式的影响及不同生长调节剂组合对愈伤组织诱导、愈伤组织分化、不定芽诱导及腋芽增殖的影响。结果表明： ① 腋芽增殖途径的培养基配方为 MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L(增殖系数为3.1)；② 适宜的愈伤组织诱导培养基为 MS+2,4 — D 4mg/L +6 — BA 0.5mg/ L，其中以带腋芽的茎段为外植体诱导率较高，可达85.7%。BA浓度为4.0～6.0mg/L时，不定芽的形成率最高，达97.5%；③ 增加BA和琼脂的浓度利于防止圆山药的褐化。

薯蓣；圆山药；离体培养；愈伤组织；不定芽

圆山药(Dioscorearotundata)俗称白薯蓣，为薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)植物，它地上部分为大型藤本，地下具有团块状的块茎，与黄薯蓣(Dioscoreacayenensis)为相同种，通称几内亚薯蓣，原产非洲，为当地居民的主要食物之一。块茎中不仅具有较高含量的碳水化合物，还有蛋白质和其他的成分，也广泛用于保健品和壮阳药物的制造[1-2]。

因圆山药的营养和药用价值较高，国外对其进行试管苗和微块茎的离体诱导报道较多[1-2]，但国内的报道较少。本研究拟以产于日本的当年生圆山药块茎为材料，筛选适宜的培养基配方和培养条件，建立离体培养体系，便于圆山药在我国的驯化引种和有效成分提取的研究[3-5]。

1 材料与方法

1.1 材料

以产于日本的当年生圆山药块茎(重约100g)为材料(如图1)，置于人工气候箱中发芽后种于湖南农业大学基地。待长出大量藤蔓后，分别切割其地上各部分和地下块茎作为外植体。

1.2 方法

1.2.1 外植体的消毒与接种 将各外植体以流水冲净，用70%酒精浸泡(30s)后转入0.1%的升汞溶液中消毒(9min)，无菌水冲洗3次。把叶片切块(1cm×1cm)、茎段切段(0.8～1cm)，块茎切块(1cm×1cm×2mm)，分别接种在愈伤组织诱导培养基上，探讨不同消毒方式对培养的影响。

1.2.2 培养基的配制及培养条件 基本培养基为MS，附加不同种类和浓度配比的植物生长调节剂(2,4 — D、6 — BA和NAA等)，蔗糖3%，琼脂0.7%，pH值为5.8～6.0。121 ℃高压灭菌20min。以上每组试验中每100mL三角瓶接种4枚外植体，10瓶为1个处理，每个处理设3次重复。探讨不同消毒方式对培养的影响。

培养条件： 培养温度为24±2℃，光照强度为2000lx，光照时间12～14h/d。

1.2.3 圆山药组织培养中褐化现象的研究 BA的浓度对褐化的影响: 取墨西哥薯蓣的茎段，常规灭菌后分别接种在MS+2,4 — D 2.0mg/L+BA(0.5～5mg/L),pH为5.8～6.0,附加蔗糖3%、琼脂浓度0.7%的培养基上，观察BA的浓度对褐化的影响。(其他培养条件同上)

培养基硬度对褐化研究: 不同的外植体经常规灭菌后，接种在MS+2，4 — D 2.0mg/L+BA 0.5mg/L，附加不同浓度琼脂，pH为5.8～6.0，附加蔗糖3%的培养基上(其他培养条件同上)，观察培养基的硬度对褐化的影响。

以上各项试验均为随机区组设计。

2 结果与分析

2.1 圆山药的腋芽增殖培养

将圆山药带腋芽的茎段接种在不同的培养基中，观察不同种类和浓度配比的生长调节剂对墨西哥薯蓣茎段增殖的影响。35d后统计芽增殖倍数，结果见表1。

表1 不同种类和浓度配比的生长调节剂对腋芽增殖的影响Tab.1 Effectsofdifferentcombinationofplantgrowthregulatorsonbudmultiplication培养基编号No.MediumBA(mg/L)KT(mg/L)NAA(mg/L)接种外植体数(个)Numberofexplants增殖倍数Timesofmultiplication10.20.00.2401.020.50.00.2401.031.00.00.2401.842.00.00.2402.253.00.00.2403.164.00.00.2402.770.01.00.2401.180.02.00.2401.5

从表1可知：带腋芽的茎段经35d培养后，在以MS+BA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L的培养基上，芽的增殖倍数最低，仅为0.3，大部分圆山药的茎段的基部褐化严重，腋芽枯黄，最后死亡；而当BA 浓度为3.0mg/L、NAA为0.2mg/L 的培养基上，墨西哥薯蓣茎段基部也有部分褐化，但芽正常生长(如图3)，此时芽的增殖倍数达最高，平均为3.1。表明高浓度的BA和低浓度的NAA配比有利于墨西哥薯蓣的增殖。当添加的细胞分裂素为KT时，发现腋芽开始生长，但几乎无新芽长出，相对于同浓度的BA来说，其芽的增殖率较低，但腋芽健壮，茎段加粗。由此可见，MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L有利于腋芽增殖。且随着BA浓度增加到3.0mg/L，芽的增殖倍数最高。而MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L则有利于腋芽生长。

2.2 圆山药愈伤组织的诱导

2.2.1 不同外植体对圆山药愈伤组织诱导的影响 以圆山药的叶片、茎段、以及块茎为外植体,分别接种在附加2,4 — D 4.0mg/L、BA 1.0mg/L的MS基本培养基上,置于培养室中培养。35d后统计愈伤组织的诱导率,观察不同外植体对圆山药愈伤组织形成的影响。结果见表2。

2.2.2 不同生长调节剂配比对墨西哥薯蓣愈伤组织诱导的影响 将墨西哥薯蓣的茎段接种在以MS为基本培养基,附加不同种类和浓度配比的生长调节剂的培养基上,置于培养室中培养,35d 后统计愈伤组织诱导率,结果见表3。

表2 不同外植体对愈伤组织诱导的影响Tab.2 Effectsofdifferentexplantsoncallusinduction外植体Originofexplants接种外植体数(个)Numberofexplants形成愈伤组织块数(块)Numberoftissuesformedcallus愈伤组织诱导率(%)Inductionrateofcallus叶片402255.0茎段402665.0带腋芽的茎段353085.7块茎4200.0

从表3中可以看出: 圆山药愈伤组织的诱导受不同浓度配比生长调节剂的影响。在MS附加2,4 — D 4.0mg/L和BA 1.0mg/L时圆山药愈伤组织的诱导率最高,为80 %,此时愈伤组织质地紧密,为白色颗粒状(如图2),但此类愈伤组织在继代培养中易于褐化。在附加NAA 4.0mg/L与 BA 1.0mg/L的培养基上,愈伤组织也是白色,质地致密,但是愈伤组织诱导率较低。可见,在含有低浓度的生长素的培养基上, 圆山药的茎段很难被诱导形成愈伤组织.在附加2,4 — D与BA组合的培养基上诱导愈伤组织的效果好,并且生长素与细胞分裂素的比值偏大,有利于提高诱导率。

表3 不同种类和浓度配比的生长调节剂对愈伤组织诱导的影响Tab.3 Effectsofdifferentcombinationofplantgrowthregulatorsoncallusinduction生长调节剂浓度(mg/L)Concentrationofplantgrowthregulators接种外植体数(个)Numberofexplants形成愈伤组织的块数(块)Numberoftissuesformedcallus愈伤组织诱导率(%)InductionrateofcallusNAA2,4—DBA1.00.00.53300.02.00.00.533618.14.00.01.0341647.00.01.00.13500.00.02.00.5361233.30.04.00.5322268.80.04.01.0302480.01.00.03.0311032.22.00.00.537821.6

同浓度的 2,4 — D和NAA比较,2,4 — D对墨西哥薯蓣愈伤组织的诱导率虽然较低为32.2%,但所生成的愈伤组织为鲜绿色,质地紧密,且在继代培养中增殖较快,不易褐化死亡。

综上所述，适宜的愈伤组织诱导培养基组成为MS+2,4 — D 4.0mg/L+BA 0.5mg/L或MS+BA 4.0mg/L+2,4 — D 0.5～1.0mg/L。

2.3 丛生芽诱导

将墨西哥薯蓣的顶芽接种在以MS为基本培养基，附加不同种类和浓度配比的生长调节剂的培养基上，置于培养室中培养，发现接种10d后，愈伤组织的表面有许多小芽点，此后，小芽点逐渐长大形成绿色的不定芽(如图3)。35d统计芽增殖数，结果见表4。

从表4可以看出： 低浓度的BA对墨西哥愈伤组织形成芽的影响较小，当BA浓度为1.0mg/L时，不定芽的形成率仅为12.5%，每块愈伤组织产生的芽数最多为3个；随着BA浓度的升高，墨西哥薯蓣组织的分化率增加，所形成的芽数增多，当BA浓度为4.0～6.0mg/L时，不定芽的形成率最高，达97.5%，且每块愈伤组织生成的不定芽数也最多，平均为9个，但在BA浓度为6.0mg/L，可观察到部分不定芽发生了玻璃化现象。在KT与NAA配比的培养基上，墨西哥薯蓣的愈伤组织也可以分化，产生不定芽，但其不定芽的形成率仅为同浓度BA的70%左右，生成的芽数也较少。结果表明，墨西哥薯蓣丛生芽的诱导所适用BA的浓度为4.0mg/L。

表4 不同种类和浓度配比的生长调节剂对丛生芽诱导的影响Tab.4 Effectsofdifferentcombinationofplantgrowthregulatorsonbudregeneration生长调节剂浓度(mg/L)Concentrationofplantgrowthregulators接种愈伤组织块数(块)Numberofinoculatedcallus产生不定芽愈伤组织数(个)Numberofcallusformedbuds分化率(%)Differentiationrate增殖倍数TimesofmultiplicationBAKTNAA1.00.00.240512.532.00.00.2401537.564.00.00.2403997.566.00.00.2403997.590.02.00.2401332.530.04.00.2403177.54

2.4 试管苗的生根

不定芽长至3～4cm时，将其切下，接种在供试培养基上，观察不同生长调节剂配比对圆山药试管苗生根的影响。结果见表5。

表5结果显示，在25d时，生长调节剂浓度对圆山药的生根率影响效果不太明显，但随时间延长至35d时，茎叶繁茂的植株能依靠自身产生不定根，最高可达到88%。 具有自身所产不定根的植株移栽成活率可达到100%。

表5 不同种类和浓度配比的生长调节剂对试管苗生根的影响Tab.5 Effectsofdifferentcombinationofplantgrowthregulatorsonrootinduction基本培养基Mediumtype生长调节剂浓度(mg/L)Concentrationofplantgrowthregulator接种外植体数(个)Numberofexplants25d生根率(%)Rootingrateat25d35d生根率(%)Rootingrateat35dNAABAKT1/2MS1.00.00.0400.0301/2MS0.00.20.04033.3781/2MS0.00.00.24036.6851/2MS0.00.00.24032.0821/2MS1.00.20.04041.288MS1.00.00.24025.576

圆山药不同外植体在组织培养的过程中均会发生不同程度的褐化现象，多出现在培养材料的切口处(如图6)。

2.5 BA浓度对褐化的影响

取室内栽培的墨西哥薯蓣的茎段，经常规灭菌后接种在以MS为基本培养基和附加不同浓度BA和同一浓度的2，4 — D的培养基上，结果见表6。

表6 不同浓度6—BA对褐化现象的影响Tab.6 Effectsofdifferentconcentrationof6—BAonpla-ntletbrowning6—BA浓度(mg/L)Concentrationof6-BA接种外植体数(个)Numberofexplants褐化数(个)Numberofbr-owningtissues褐化率(%)Browningrate0.5402665.02.0402152.54.0401640.06.0401435.0

从表6可以看出，不同浓度的BA对圆山药组织褐化现象有明显的影响。当BA为0.5mg/L时，褐化率最高达65.0%，而当BA浓度为6.0mg/L时，褐化率降低了1倍多。由此可见：随着BA浓度的升高，褐化率也随之下降。在培养基中适当增加BA的浓度有利于防止圆山药的褐化现象。

2.6 培养基硬度对褐化的影响

将圆山药的茎段常规消毒后接种在MS+2,4 — D 3.0mg/L+BA 0.5mg/L附加不同琼脂浓度的培养基上，培养30d，统计褐化率，结果见表7。

由表7可以看出，当琼脂浓度为7.5g/L时，褐化率最低，为37.5%，但培养基过硬，不利于外植体对培养基中养料的吸收，进而影响愈伤组织的形成。由此可见，琼脂浓度升高，培养基硬度增大，褐化则降低，反之亦然。

表7 培养基硬度对褐化研究Tab.7 Effectsofdifferentconcentrationofagaronbrowning琼脂浓度(g/L)Concentrationofagar接种外植体数(个)Numberofinoculatedcallus褐化数(个)Numberofbrowningcallus褐化率(%)Browningrate5.5402767.56.5402050.07.5401537.5

3 讨论

本试验中，严重影响培养的一个重要因素就是当外植体的生长速度小于其褐化的进程时，整个外植体会大面积褐化；随着时间的延长，外植体逐渐完全褐化、死亡。而褐化的物质会扩散到培养基中累积起来，导致培养基颜色的改变和培养效果的降低。这与颜昌敬[6]的观点一致。尽管严重的褐化在该试验中无法消除，但采取适当方法，可以从一定程度上减轻其影响。

徐振彪等[7]指出影响变褐的因素很多，接种时外植体的处理、培养温度、外植体种类、培养基种类、继代次数、外植体的放置方式、活性炭对组织培养过程中的变褐现象有影响。

有研究表明，随着BA浓度的升高，外植体的褐化率也随之升高[8-9]，而在本实验研究发现，随着BA浓度的升高，褐化率则随之下降。2，4 — D所产生的愈伤组织容易褐化，在取不同浓度的BA组合中，高浓度BA所产生的愈伤组织颜色鲜绿，不易褐化。推测产生此结果的原因可能是不同植物对BA的反应不同，墨西哥薯蓣在较高浓度的BA时可以产生愈伤组织，进而使外植体的生长速度大于其褐化的进程。

因此，今后要从如何降低褐化程度着手，进而达到加快繁殖的目的。

[1] Balogun M O , Fawole I, Ng S Y C，et al. Interaction among cultural factors in microtuberization of white yam (Dioscorearotundata)[J]. Tropical Science.2006, 46(1):51-59.

[2] Adeniyi O J, Adetimirin V O , Ingelbrecht I et al. Shoot and plantlet regeneration from meristems ofDioscorearotundataPoir andDioscoreaalataL.[J]. African Journal of Biotechnology, 2008,7 (8):1003-1008.

[3] 杭悦宇，周太炎,丁志遵，等．山药类中药的氨基酸和微量元素的分析[J]. 中药通报，1988，13(7)：37-39.

[4] 丁志遵，唐世蓉，秦慧贞，等．甾体激素药源植物[M]. 北京：科学出版社,1983:22-42.

[5] 李月仙, 黄东益, 黄小龙, 等. 山药的研究进展[J],中国农学通报,2009, 25(09):91-96.

[6] 颜昌敬. 植物组织培养手册[M].上海:上海科学技术出版社. 1990：26-31.

[7] 徐振彪,傅作申,原亚萍, 等. 植物组织培养过程中的褐化现象[J].国外农学：杂粮作物. 1997(1): 55-56.

[8] 邱璐,陈善娜,夏跃明,等.桑树组织培养中褐化问题的研究[J]. 云南大学学报:自然科学版,2000.22(1)：76-78．

[9] 杜研,李毅,马彦军, 等. 几种影响沙棘组织培养外植体褐化因子分析[J]. 2007, 30(5): 40-43.

(责任编辑：谭著明)

InvitrocultureofDioscorearotundata

JIN Mi, PENG Xiaoying*, ZHOU Shuangde, PENG Jinhui, LI Ying

(Bioscience and Biotechnology College of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Aninvitroprotocol was developed for multiplication ofDioscorearotundataby using leaves, stem, tuber and adventitious root derived from plants grown in pot as explants. Effects of different plant growth regulators on callus induction, callus differentiation, adventitious bud induction and axillary bud multiplication were studied. The results showed that the optimum medium for proliferation of axillary bud located below the shoot tip was MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L (3.1 for coefficient of multiplication). The optimum medium for callus induction was MS+2,4-D 4mg/L+6-BA 0.5mg/L, and the rate of callus inducement was as high as 85.7% when stems with axillary buds were used as explants. When the concentration of BA was 4.0～6.0mg/L, the rate of adventitious bud formation could up to 97.5%. Increasing the concentration of BA and agar could decrease browning during the culture.

Dioscorea;Dioscorearotundata; vitro culture; callus; adventitious bud

2010 — 09 — 20

2010 — 11 — 19

金 密(1975 — )，女，湖南省长沙市人，讲师，硕士，研究方向为植物学。

* 为通讯作者

S 632.1

A

1003 — 5710(2010)06 — 0001 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2010. 06. 001