诺龙甲醇溶液标准物质的研制*

苏福海 全 灿 王海峰 李红梅

(中国计量科学研究院，化学计量与分析科学研究所，北京 100013)

诺龙(Nandrolone)是蛋白同化雄性类固醇药物，活性较为显著[1-3]，既能增强从氨基酸合成蛋白质，又能抑制氨基酸分解生成尿素，并有促进体内钙质蓄积的功能。其同化作用较其它睾丸素类衍生物强大而持久，而其男性激素作用却较小。2008年世界反兴奋剂机构(WADA)公布的《禁用物质清单》列举的蛋白同化制剂主要包括诺龙等9种蛋白同化类固醇类兴奋剂[4，5]。目前国内还没有诺龙的标准物质用于检测，因此为了能够支持动物源性食品中违禁药物的检测分析，确保检测结果的可靠性、可比性和溯源性[6，7]，笔者研究了诺龙甲醇溶液标准物质的制备。由于一切测量结果不可避免地具有不确定度[8]，而化学分析者使用的标准物质量值的准确性以及不确定度水平是影响分析结果的一个重要的因素。为此笔者分析了标准物质定值过程中的不确定度来源[9]，并对不确定度进行了评定。

1 诺龙纯品原料定性分析

所需纯品原料主要采用市售产品，诺龙(纯度大于99%，美国Fluka公司)经真空包装密封储存在保干器并冷藏于4℃冰箱中，甲醇试剂为色谱纯(纯度大于99.8%，美国Riedel-de-Haen公司)。

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪:LC-20A型，日本岛津公司；

Inertsil ODS-SP色谱柱:250 mm×4.6 mm, 5 μm ，日本GL科学仪器公司；

红外光谱仪：AVATAR 330FT-IR型，美国Thermo Nicolet公司。

1.2 液相色谱-质联法分析

图1为诺龙的液相色谱-质联法(LC-MS)谱图，由图1可以看出分子离子峰(M+H)+的质荷比m/z为275.2，是诺龙分子量(274.4)与氢原子量(1.0)之和，因此可以初步对诺龙定性。

图1 诺龙原料的LC-MS谱图

1.3 红外光谱法分析

诺龙纯品原料和诺龙标准的红外光谱分别如图2、图3所示，通过比较图2和图3可知，诺龙纯品原料红外光谱图与诺龙标准红外光谱图一致，可以确认纯品原料为诺龙。

图2 诺龙原料纯品的红外光谱图

图3 诺龙标准红外光谱图

2 诺龙纯品原料纯度定值

纯品原料中主成分定值方法参照国际上各个国家计量实验室通用方法。高纯有机化合物标准物质的定值方案，国外最早形成于20世纪70年代，对纯度为99%以上的化合物，通常选择高效液相色谱(HPLC)归一化法对其纯度进行定值[10-12]。因此采用多家实验室联合定值的方法，共有7家实验室参与，每家实验室发放7瓶样品，其中1瓶提供7个纯度值，其余6瓶各给出3个纯度值。选择以下色谱条件：流动相为水(含0.1% HAc)-乙腈(体积比为50∶50)等度洗脱，流速为1.0 mL/min；色谱柱：Inertsil ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；进样量：5 μL(1.00 mg/mL的诺龙甲醇溶液)；监测波长：220、230、235、242、250、260 nm；定值波长：242 nm。

表1 诺龙纯度多家合作定值结果 %

对表1数据进行统计检验，结果列于表2。

表2 统计检验结果

3 诺龙甲醇溶液标准物质制备

诺龙甲醇溶液标准物质是采用重量法精确制备，方法如下：使用经过检定合格的分析天平(分度0.1 mg)准确称量经过纯度分析的标准物质原料纯品300～500 mg,转移溶质于准确称重过的洁净锥形瓶中。在另一个分析天平(分度0.01 g)，加入一定质量的甲醇至锥形瓶中，所需的甲醇质量根据甲醇的密度0.791 g/mL和拟配制的诺龙体积浓度计算得出。精确称量所加入甲醇的质量，充分混匀，制得诺龙甲醇溶液标准物质，浓度为1.00 mg/mL。

利用重量法配制了200瓶以上浓度为1.00 mg/mL的诺龙甲醇溶液标准物质，使用液相色谱法对所配制溶液进行核验，核验结果列于表3。

表3 甲醇溶液标准物质

注：甲醇密度 (20℃) 为0.791 g/mL。

4 诺龙甲醇溶液标准物质均匀性检验

根据JJG 1006-1994《一级标准物质技术规范》的要求对研制的溶液标准物质进行均匀性检验。具体抽样检验方法为：从每种标准物质中随机抽取11瓶，进行瓶间均匀性检验；再取任意一瓶，取7个子样，进行瓶内均匀性检验(采用HPLC法测定)，检验结果见表4。对表4数据进行F检验和t检验，证明标准物质瓶内和瓶间样品均匀一致[13]。

表4 诺龙甲醇溶液标准物质均匀性检验结果

5 诺龙甲醇溶液标准物质稳定性检验

标准物质稳定性考察按先密后疏的原则，在一定时间间隔内选择定值方法即液相色谱法，检测在规定条件下保存的标准物质纯度随时间的变化情况，通常分别在第1、2、3、6个月进行稳定性监测。每次取5个包装，每个包装取一个子样，检测3次，计算平均值，把5个包装测量结果平均值作为检测结果，检验结果列于表5。实验证明诺龙溶液标准物质在监测期间内是稳定的。

表5 诺龙溶液标准物质稳定性考察

6 诺龙甲醇溶液标准物质定值不确定度评定

6.1 液相色谱法纯度定值引入的不确定度

(1)液相色谱法定值测量重复性引入的不确定度u1=0.01%；

(2)各组分在不同检测波长下响应差异引入的不确定度u2

综合考虑主成分和杂质化合物在相应检测波长下的响应，各组分引入的不确定度u2-i采用以下公式进行量化：

纯度定值标准不确定度为：

uLC,rel=0.03%/99.64%=0.03%

6.2 合作定值结果的不确定度

液相色谱合作定值产生的不确定度列于表6。

表6 液相色谱法合作定值结果不确定度

根据表5，u多家，rel=0.07%/99.64%=0.07%

6.3 溶液制备过程引入的不确定度

(1)天平称量引入不确定度

天平称量不确定度主要来源于天平称量最大允许误差、天平称量变动性、浮力影响 (在常规状态下称重，此项可忽略)。

纯品原料称量使用0.1 mg分度的分析天平，天平的变动性、检定误差等估计为0.05 mg，称样量为400 mg，按矩形分布，相对不确定度为0.007%。

甲醇的称量使用0.01 g分度的分析天平，天平的变动性、检定误差等估计为0.01 g，称样量为300 g，按矩形分布，相对不确定度为0.002%。

(2)温度对体积的影响引入的不确定度

因此，诺龙溶液标准物质配制引入的相对不确定度为：

6.4 诺龙甲醇溶液核验引入的不确定度

利用重量法配制了浓度为1.00 mg/mL的诺龙甲醇溶液标准物质，使用液相色谱法对所配制溶液进行了核验，以其7次重复测量的相对标准偏差RSD计入结果不确定度评定中，经计算,u核验,rel=0.14%。

6.5 合成相对不确定度

取k=2,则相对扩展不确定度为:

U=0.38%×2≈1.0 %

诺龙溶液标准物质浓度为1.00 mg/mL时，相对扩展不确定度为1.0% (k=2)。

7 结语

采用红外光谱、质谱法对纯度大于99%的诺龙市售产品经定性分析后，利用HPLC面积归一化方法对诺龙原料纯度进行定值；利用重量法配制浓度为1.00 mg/mL的诺龙甲醇溶液标准物质，并进行了均匀性、稳定性检测；对浓度定值结果进行了不确定评定。所研制的诺龙溶液标准物质，对于保证检测实验室测量结果的准确可靠与互认、避免在食品检测中出现“测不准”问题具有重要意义。

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