荧光光谱法研究橙皮甙与牛血清白蛋白的相互作用*

尚永辉 孙家娟 刘 静 耿 薇

(咸阳师范学院化学与化工学院，咸阳 712000)

药物进入人体后首先与血清白蛋白结合,通过血浆的存储和运输,到达受体部位产生药理作用[1]。通过测定血清白蛋白的变化,可为疾病诊断、疗效观察等提供有价值的资料及数据。荧光光谱法是目前研究蛋白质与药物分子相互作用的重要手段之一。

橙皮甙(Hesperidinum)属黄酮类化合物，具有抗炎，抗病毒以及降低毛细血管脆性，防止微血管破裂出血等多种功效，是目前治疗高血压和心肌梗塞的常用药物之一。实验在pH 7.40的Tris-HCl缓冲介质中运用荧光光谱技术研究了橙皮甙与BSA的相互作用，并对其作用机理进行了初步分析。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

荧光分光光度计：RF-5301型，日本岛津公司；

电子分析天平：HA-180MF型，日本日立公司；

牛血清白蛋白(BSA)：Amresco.0930，分子量为65 000；

橙皮甙：对照品，中国药品生物制品检定所；

Tris-HCl缓冲溶液：pH 7.40；

Tris、HCl：分析纯；

实验用水为双重蒸馏水；

以Tris-HCl缓冲溶液为溶剂分别配制浓度均为1.0×10-3mol/L的BSA标准溶液和橙皮甙标准溶液，两种标准溶液均在0～4℃的冰箱中保存，实验所需浓度由此稀释而得。

1.2 实验方法

在10 mL比色管中依次加入Tris-HCl缓冲溶液2.0 mL、1.0×10-3mol/L BSA溶液0.1 mL以及一定量橙皮甙溶液，采用双重蒸馏水稀释至刻线，摇匀，分别在295、303、310、315K 4个实验温度下恒温1 h，采用1 cm石英比色皿，以285 nm为激发波长，绘制300～500 nm的荧光光谱和Δλ=60 nm，Δλ=15 nm的同步荧光光谱，测定中入射狭缝与出射狭缝宽度均为3 nm。

2 结果与讨论

2.1 荧光猝灭光谱

按照1.2方法分别测定了实验温度下橙皮甙对BSA的荧光猝灭光谱(310 K的荧光光谱见图1)。

cBSA=0.1×10-4 mol/L； c Hesperidinum 从1到16依次为0、0.2、……、2.8、3.0 μmol/L图1 橙皮甙对BSA荧光光谱的影响(T=311K)

由图1可知，随着橙皮甙浓度的逐渐增加，BSA的荧光强度逐渐降低，这是由于蛋白质中存在的色氨酸和酪氨酸使其具有内源荧光，当固定BSA的量不断增加橙皮甙的浓度时, 橙皮甙与BSA之间的相互作用导致BSA内源荧光强度有规律地猝灭。

2.2 荧光猝灭机理及猝灭常数的测定

引起BSA荧光猝灭的原因有动态猝灭和静态猝灭。两种过程均遵从Stern-Volmer方程[2]，随温度的升高动态猝灭常数逐渐增大，而静态猝灭常数逐渐减小，由此可判断荧光猝灭类型。

根据不同温度下橙皮甙对BSA猝灭的Stern-Volmer曲线，可以得到不同温度下橙皮甙对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer方程及猝灭常数，数据列于表1。

表1 不同温度下橙皮甙对BSA的猝灭常数

注：表中F0，F分别表示加入猝灭剂橙皮甙前后BSA的荧光强度，[Q]为猝灭剂橙皮甙浓度，Kq为猝灭常数。

随温度升高猝灭常数(Kq)逐渐增加，表明橙皮苷对BSA的猝灭过程应该是以动态猝灭为主。各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数约为2×1010L/(mol·s),而从表1结果来看,Kq均大于该值，由此考虑，猝灭过程应为静态猝灭，但考虑到离子强度是影响猝灭系数的重要因素，实验采用0.1 mol/L NaCl以控制溶液离子强度，笔者认为Kq的增大可能是离子强度影响的结果[3]。

2.3 牛血清白蛋白与橙皮甙结合反应的热力学性质及作用力

根据文献计算出310、315K温度下橙皮甙与BSA作用的热力学参数自由能变ΔG=-28.92 kJ/mol(310K)，ΔG=-27.34 kJ/mol(310K)，焓变ΔH=70.71 kJ/mol，熵变ΔS=316.29 J/mol，由ΔG<0得知橙皮甙与BSA的结合过程是自发进行的，根据Ross等[4]总结出的判断生物大分子与小分子结合力性质的热力学规律，ΔH>0和ΔS>0表明橙皮甙与BSA结合过程以疏水作用力为主。

2.4 橙皮甙与BSA的表观结合常数Kb以及结合位点数n

当小分子与大分子结合时，其表观结合常数Kb与结合位点数n由下式求出[5]:

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[Q]

在实验温度下绘制不同浓度的橙皮甙与BSA的lg[(F0-F)/F]～lg[Q]的双对数图，根据截距和斜率求得相应的Kb和n，结果见表2。

由表2可看出,结合位点数n接近1，表明橙皮甙与BSA可形成一个结合位点。橙皮甙与BSA的结合常数Kb值在104数量级以上,表明橙皮甙与BSA之间有较强的结合作用，可以被蛋白质运输和储存。

表2 橙皮甙与BSA的表观结合常数Kb以及结合位点数n

2.5 同步荧光光谱

由于芳香氨基酸残基的最大发射波长与其所处环境极性有关,可由发射波长的改变可判断BSA中芳香氨基酸残基所处微环境的变化情况。Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步荧光光谱分别显示酪氨酸残基和色氨酸残基的光谱特征[4]。固定BSA浓度为1.0×10-5mol/L，逐渐改变橙皮甙浓度分别测定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步荧光光谱(图略)，由图可知，酪氨酸残基和色氨酸残基的荧光发射峰强度均随橙皮甙浓度的增加而产生猝灭，酪氨酸残基，色氨酸荧光发射峰的位置均无明显移动,表明橙皮甙对蛋白质微环境构象的改变不大[6]。色氨酸荧光发射波长与BSA的荧光发射波长接近,且色氨酸残基荧光猝灭程度比酪氨酸残基更显著，表明BSA的荧光主要由色氨酸残基所贡献，结合位点更接近于色氨酸残基。

3 结语

采用荧光光谱技术研究了橙皮甙与BSA的相互作用。结果表明：橙皮甙对BSA的荧光猝灭属于动态猝灭过程。两者之间的相互作用是靠疏水作用力相结合的一个自发过程，应用同步荧光光谱考察了橙皮甙对BSA构象的影响。

[1] Olson R E，Christ D D. Plasma protein binding of drugs[J]. Annu Rep Med Chem, 1996,31:327-336.

[2] Sun S F, Zhou B, Hou H N. Studies on the interaction between International Oxaprozin-E and bovine serum albumin by spectroscopic methods[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2006,39(4-5):197-200.

[3] 陈国珍,黄贤智,许金钩, 等.荧光分析法[M].北京:科学出版社, 1990:502.

[4] Ross P D, Subramanian S. Thermodynamics of protein association reactions: forces contributing to stability[J]. Biochemistry, 1981, 20: 3 096-3 102.

[5] Lakowicz J R, Weber G. Quenching of fluorescence by oxygen probe for structural fluctuationsin macromolecules[J].Biochemistry, 1973, 12(21): 4 161-4 170.

[6] 杜秀莲,李荣昌,王夔. 用同步荧光光谱法研究铽(Ⅲ)与脱铁运铁蛋白的作用[J].科学通报, 2001,46(5):394-396.