辛基酚聚氧乙烯醚降解菌的分离鉴定及降解特性研究

张 谔，俞国平

（同济大学环境科学与工程学院，上海200092）

烷基酚聚氧乙烯醚（Alkylphenol polyethoxylates，APEOn），例如辛基酚聚氧乙烯醚（OPEOn）是重要的非离子表面活性剂。研究发现，APEOn的生物降解产物烷基酚（alkylphenol，AP）、烷基酚乙烯醚低聚物APEO1和APEO2等具有内分泌干扰物活性［1－4］，其中辛基酚（Octylphenol，OP）是APEOn降解产物中环境雌激素活性最强的［5－6］，其雌激素效应比壬基酚强40余倍［7］。本研究从农田土壤及池塘水中分离得到2株OPEOn降解菌，并对其进行了16SrDNA鉴定和降解性能试验考察，旨在揭示OPEOn生物降解规律，以期为OPEOn污染的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂材料

辛基酚聚氧乙烯醚（OPEOn）（AMRESCO公司），商品名Triton X－100，Reagent Grade，由各种不同支链的同分异构体组成，乙氧基平均链长为9.5。

1.2 菌种富集、分离纯化和培养基组成

试验样品于2006年11月取自上海市闵行区幸福村农田土壤及池塘水，共11份。

配制无机盐溶液（g／L）：NaCl（2.5），（NH4）2SO4（2.0），MgSO4·7H2O（0.3），CaCl2（0.01），Na2HPO4（3.7），KH2PO4（0.9），Vitamin溶液：2mL／L，Trace element溶液：1mL／L，pH值为6.8～7.0。

Vitamin溶液成分如下（mg／L）：pyridoxine hydrochloride（10.0），riboflavin（5.0），thiamine hydrochloride（5.0），nicotinic acid（5.0），lipoic acid（5.0），p－aminobenzoic acid（5.0），biotin（2.0），folic acid（2.0），vitamin B12（0.1）。

Trace element溶液的成分如下（mg／L）：MnCl2· H2O（20.0），CoCl2·6H2O（4.0），Na2MO4·2H2O（26.0），FeCl3·6H2O（15.0），配好后经高压灭菌（120℃，20min）备用。

1.3 16SrDNA扩增和序列测定

收集菌体，提取DNA作为扩增模板。16SrDNA扩增的PCR反应所用的正向引物Pf：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′；反向引物Pr：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′，分别对应于大肠杆菌的16SrRNA基因的8－27和1492－1510碱基。引物合成及测序工作由上海基康生物技术有限公司完成，PCR反应体系（25μL）为：10×PCR缓冲液2.5μL，MgCl2（25mM）1μL，dNTP（2.5 mM）1μL，引物各0.5μL，模板DNA 1μL，Taq酶（5U／μL）0.25μL，重蒸水18.25μL。

1.4 OPEOn降解菌生长曲线及总有机碳的测定

OPEOn降解菌生长曲线的测定采用WFJ7200型可见分光光度计，测定菌液的OD600值。

菌液中未被降解的OPEOn的含量采用TOC仪测定。菌液在高速离心机中以4 000r／mim离心5min后，取上清液按比例稀释后测定TOC值。TOC仪为Multi N／C 3000TOC／TN Analyzer，进样量20mL。

2 结果与讨论

2.1 OPEOn降解菌的分离

使用以OPEOn为唯一碳源的培养基，对11份土壤及池塘水样进行4个月驯化后，生长明显的3份进行固体平板划线分离，挑取单菌落，反复划线纯化，共分离得到3株可降解OPEOn的菌株。测定5d内对100mg／L OPEOn的降解能力，结果如表1所示，其中以菌株X－4及X－6的降解率最高，因此选择X－4及X－6作为进一步研究的菌种。

表1 OPEOn降解菌的降解率

2.2 菌株鉴定

2.2.1 菌落形态及生化鉴定

菌株X－4菌落直径大小为1～1.5mm，圆形，边缘整齐，有光泽，呈淡黄色，精氨酸双水解酶反应呈阴性，革兰氏反应呈阳性；菌株X－6菌落直径大小为1～1.5mm，圆形，边缘整齐，有光泽，呈乳白色，半透明，精氨酸双水解酶反应呈阴性，革兰氏反应呈阴性。

2.2.2 16SrDNA序列测序结果分析

菌株X－4的16SrDNA共测得1 453个碱基，X－6为825个碱基，所得序列在GenBank上登录，登录号分别为DQ 286 360.1及AY 987 735.1／AM 184 292.1。结果表明，菌株X－4与菌种Bacillus sphaericus亲源关系最近，二者的16SrDNA的相似性为99%。菌株X－6与菌株Aeromonas hydrophila或Aeromonas punctata亲源关系最近，X－6与2菌株的16SrDNA的相似性均为99%。结合菌株的形态和生理生化特征，菌株X－4初步鉴定为Bacillus sphaericus，X－6为Aeromonas hydrophila或Aeromonas punctata。

2.3 接种量对OPEOn降解的影响

在一系列初始pH值为7.0的无机盐培养基中，分别以0.5%，1.0%，1.5%，2.0%的接种量分别接入X－4，X－6菌体，OPEOn初始浓度均为20 mg／L，置于30℃，150r／min摇床避光培养，每24h取样1次，测定其TOC值。接种量对菌株X－4，X－6降解OPEOn的影响见图1和图2。

图1 接种量对菌株X－4降解能力的影响

图2 接种量对菌株X－6降解能力的影响

由图1和图2可见，接种量在0.5%～2.0%时，降解OPEOn的速率和起始接种量呈正相关。考虑到本试验中单纯使用以TOC值表征的OPEOn含量的变化并不能说明不同接种比下，OPEOn的降解效率，故自定义“接种效率”概念，“接种效率”的计算方法如下：

由此公式可以计算得出：菌株X－4在接种比为1.0%时，“接种效率”最高，达到22.9%；菌株X－6在接种比为1.5%时，“接种效率”最高，达到22.0%。此外，当接种比为1.0时，X－6的“接种效率”为21.2%。在本次试验中，为简化操作，设定2菌株的接种比均为1.0%。

2.4 OPEOn培养基浓度对降解的影响

配制OPEOn浓度分别为5，20，50，100，200，1 000mg／L的OPEOn培养基，溶剂为无机盐溶液，pH值为7.0。菌株X－4及X－6均以1%的接种比接入各浓度培养基。接菌后置于30℃，150r／min摇床避光培养，每24h取样1次，并测TOC值。OPEOn浓度对菌株X－4及X－6降解OPEOn的影响见图3和图4。

图3 OPEOn浓度对菌株X－4降解能力的影响

图4 OPEOn浓度对菌株X－6降解能力的影响

由图3和图4可见，菌株X－4及X－6均在培养基OPEOn浓度为20mg／L时，达到最高降解率。Boopathy［8］曾指出，培养基中有机物含量过高，会对菌体生长产生抑制作用或毒害作用，太低则会限制菌体的生长。Hsi－Jien Chen［9］等研究了5种OPEOn降解菌的降解性能，所使用培养基中OPEOn浓度范围为0.1mg／L～100 000mg／L，5种OPEOn降解菌生长的最适OPEOn浓度，最低质量浓度为100mg／L，最高质量浓度为10 000mg／L。

2.5 pH值对OPEOn降解的影响

分别将OPEOn浓度为20mg／L的培养基调pH值至5.0，6.0，6.5，7.0，7.3，7.5，8.0，8.5，9.0，以1%的接种比接入菌株X－4及X－6，于30℃，150 r／min摇床避光培养5d，测其OD 600值。和大多数生物体一样，细菌对胞内外环境pH值都有一定的要求。pH值对菌株X－4及X－6降解OPEOn的影响见图5和图6。

图5 pH值对菌株X－4降解能力的影响

图6 pH值对菌株X－6降解能力的影响

图5和图6表明，菌株X－4及X－6均可以在pH值为6.0～8.5的范围内降解OPEOn。在pH值为7.3～7.5时，2菌株对OPEOn的降解率最高，这可能是由于2菌株均于冬季取自农田土壤及池塘，而此季节动植物及微生物新陈代谢缓慢，酸性物质产生较少，故土壤偏碱性，因此其中存在的微生物适应在中性偏碱性环境下生长［10］。

2.6 温度对OPEOn降解的影响

配制OPEOn质量浓度为20mg／L，pH值为7.5的培养基，以1.0%的接种比接入菌株X－4及X－6，分别于10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，150r／min摇床避光培养5d，每12h取样测其OD 600值，结果见图7和图8。

图7 温度对菌株X－4降解能力的影响

图8 温度对菌株X－6降解能力的影响

由图7和图8可知，2菌株对低温环境的适应能力要强于高温环境，可能与菌株采集的时间是在冬季有关，故2菌株可能有较强的抗寒能力。2菌株在10～40℃之间都有明显的生长，但在50℃以上时，菌株生长基本已停止。2菌株的最适生长温度为30℃，此时，菌株的降解率达到最大，X－4为26%，X－6为32%。Mann［11］等研究了OPEOn在污水处理系统中的生物降解性，发现OPEOn的生物降解性从3月的26%升高到8月末9月初的80%，而从10月到第2年的1月其降解性降低到20%～25%。他们认为生物降解性的这种随时间的变化受温度对生物活性的控制。在冷冬，温度低，生物降解性降低。实验结果与此相符。Nasu［12］和Maruyama［13］等人对壬基酚聚氧乙烯醚（NPEOn）生物降解的研究也证实了这一点。

2.7 降解动力学分析

对菌株X－4及X－6在不同OPEOn浓度下的降解率进行数学分析。

建立Monod模型，得到一级反应动力学方程式为：lnc＝－kt＋A

式中：c为OPEOn的质量浓度，mg／L，k为OPEOn降解速率的动力学常数；t为生物降解时间，d；A为常数；y为OPEOn的降解率。

运用MATLAB对试验结果进行了计算和分段拟合（见表2，表3）。

表2 不同初始浓度下X－4对OPEOn生物降解的动力学方程

表3 不同初始浓度下X－6对OPEOn生物降解的动力学方程

结果表明，2菌株的降解反应均在低浓度（5，20，50，100mg／L）时符合一级反应动力学特征，所得的动力学方程能较好地描述试验中的反应趋势，而在较高底物浓度（200，1 000mg／L）下降解反应并不符合一级反应动力学，2菌株对OPEOn的降解率均在初始浓度为20mg／L时达到最大值，其中X－4为26%，X－6为32%。这表明微生物降解OPEOn的过程存在一个合适的降解浓度，底物一方面可以诱导降解酶活性的提高，另一方面也抑制细菌的生长和生理活动，需充分考虑OPEOn浓度与微生物数量的关系。

另外，从图3及图4还可以看出，各浓度下OPEOn的降解率在3d以后变化缓慢，OPEOn浓度基本不再发生变化，出现这一现象的可能原因为：随着降解过程的进行，溶液中出现了较OPEOn更难降解的中间产物，如OP，OPEO 1，OPEO 2，OPEC 1，OPEC 2等短乙氧基链化合物。由于苯环的存在，OP，OPEO 1，OPEO 2，OPEC 1，OPEC 2在环境中具有很高的稳定性，不易被降解［14］，且具有更强的环境雌激素效应［15］。当其浓度累积到一定水平时会对微生物产生抑制。本课题目前只对OPEOn降解菌的降解特性进行了研究，进一步的研究应该包括对降解菌液进行分析，确定降解产物，以便构建2菌株对OPEOn的降解途径。

3 结 论

（1）从上海闵行幸福村农田土壤及池塘水中分离得到2株能够降解内分泌干扰物辛基酚聚氧乙烯醚（OPEOn）的菌株X－4及X－6，初步鉴定X－4为球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus），X－6为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）或点状产气单胞菌点状亚种（Aeromonas punctata）。

（2）菌株X－4降解OPEOn的最佳条件是接种量为1.0%，初始pH值为7.3～7.5，温度为30℃；X－6是接种量为1.5%，初始pH值为7.3～7.5，温度为30℃。

（3）菌株X－4及X－6对OPEOn的降解反应在低浓度（5，20，50，100mg／L）时符合一级反应动力学特征，而在较高底物浓度（200，1 000mg／L）下不能用一级反应动力学描述，2菌株对OPEOn的降解率在初始浓度为20mg／L时达到最大值，其中X－4为26%，X－6为32%。

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