GDNF修饰脂肪间质干细胞移植治疗帕金森病模型大鼠的实验研究

周井铎 邬 巍 郭云宝 鲁质成 (吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021)

GDNF修饰脂肪间质干细胞移植治疗帕金森病模型大鼠的实验研究

周井铎 邬 巍 郭云宝 鲁质成 (吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021)

目的 探讨GDNF修饰脂肪间质干细胞移植治疗帕金森病大鼠的可行性。方法 移植GNDF修饰的脂肪间质干细胞到模型大鼠纹状体内。术后定期对大鼠进行旋转行为学测试，分别于移植后的2、4、6、8 w进行移植区免疫组化检测TH表达，观察多巴胺能神经元存活。结果ADSCs表达干细胞表面标志物CD44。ELISA试剂盒检测培养上清液中有分泌的GDNF，分泌量随培养时间的延长而增加，在培养的第24、48、72、96小时分泌量分别为(533.424±204.177)、(692.431±162.044)、(1 367.893±102.876)、(1 952.201±109.690)pg/ml，未行基因转染的 ADSCs培养上清液未检测到GDNF的分泌。GDNF-ADSCs组DN神经元存活率较模型组和单纯细胞移植组高，而且在第8周时观察到该组神经元存活率比前一时间点增高约10%。阿扑吗啡诱导大鼠旋转实验显示单纯ADSCs移植组较模型组旋转次数下降，而ADSCs-GDNF组的旋转次数较ADSCs组下降，6 w以后尤其显著(P＜0.05)。结论 移植GNDF修饰的脂肪间质干细胞到模型大鼠纹状体内能够成活，TH表达阳性的多巴胺能神经元存活增加，大鼠帕金森模型行为学症状改善。

胶质源性神经营养因子;脂肪间质干细胞;多巴胺能神经元

近年来，脑内移植技术与转基因技术相结合治疗帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)，成为一新的研究热点。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是骨髓来源的多能干细胞，具有来源丰富、取材方便、操作简易、免疫原性弱、移植方法简单、能够转染长期表达外原基因的特点;并可作为基因治疗的载体，承载某些难以通过血-脑屏障的药物和细胞因子，将有治疗作用的物质释放到中枢神经系统〔1～3〕。研究证实，脂肪间质干细胞(Adiposederived stem cells，ADSCs)同样具有 BMSCs 的生物学特性〔4〕。胶质源性神经营养因子(glialeellline-derived neurotrophie factor，GDNF)可以促进中脑黑质DA能神经元存活〔5〕，并对DA神经元的存活、分化及DA的摄取表现出特异性〔6〕。有研究证明，GDNF可以促进黑质纹状体通路再生，还可以促进DA能神经元的生长〔7〕。本研究建立PD动物模型，观察移植经GDNF修饰后的ADSCs对PD动物模型的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 动物:Wistar大鼠购自吉林大学医学院动物中心。大鼠立体定向仪(日本Narishige公司，SR-6N型)，笔式小型磨钻(韩国世新精密公司)。细胞培养试剂:DMEM/F12和小牛血清(FBS)购自Gibco公司;GDNF购自PeproTech公司。酪氨酸羟化酶(TH)多克隆抗体购自武汉博士德生物公司。内毒素(LPS)购自Sigma公司。Alexa Fluor 555标记山羊抗兔IgG购自Invitrogen公司。ELISA试剂盒，Promega公司。CO2气体恒温培养箱，日本SANYO，倒置相差显微镜，Olympus。Fluview 1000激光扫描共聚集显微镜，Olympus。

1.2 方法

1.2.1 PD动物模型制备 参照大鼠立体定位图谱，将LPS注入右侧黑质，2 w后，阿扑吗啡腹腔注射(5 m l/kg体重)，PD模型旋转检测仪记录动物向对侧旋转情况，360°为一次，每次记录30 min。一般认为，平均旋转次数≥7次/min为成功的PD大鼠模型。

1.2.2 ADSCs分离、鉴定 根据参考文献〔4〕的方法进行分离。取Wistar大鼠深度麻醉后行腹股沟直切口，无菌条件下切取皮下脂肪。培养基漂洗，清除包膜、结缔组织及小血管。剪碎脂肪组织移入离心管内以0.075%胶原酶37℃消化30min。用含10%FBS的DMEM培养基终止消化，吸管轻柔吹打数次，将液性部分移入离心管，1 000 r/min离心 10 min，弃掉上清，以10%FBS的DMEM培养基再次重悬，200目滤网过滤，计数细胞存活率为90%，调整细胞浓度为1×106细胞/ml，接种于35 mm培养皿中。取第3代ADSCs，离心后弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入抗鼠CD44，行流式细胞仪鉴定。

1.2.3 ELISA法检测GDNF 取第3代培养的ADSCs，当细胞生长至60%融合时，以浓度1×109vp/ml的GDNF重组腺病毒作用细胞1 h后，转移到生长培养基继续培养，通过ELISA方法检测培养上清GDNF水平。

不同的时间点收取细胞培养上清液，用于检测GDNF的含量。检测方法参照Promega公司的说明书进行抗体包被，将GDNF单克隆抗体用包被缓冲液1∶1 000稀释后，加入96孔板中，100μl/孔，4℃孵育过夜。抗体封闭，弃除抗体包被液，每孔加入200μl封闭缓冲液，室温作用1 h。GDNF标准曲线制备。加入待测样品，每孔中加入 100μl待测上清，室温摇荡500 r/min，孵育6 h。弃除样品，用洗涤缓冲液洗涤3次。96孔板中加入抗GDNF的多克隆抗体，每孔100μl，4℃孵育过夜。洗涤缓冲液重复洗涤3次。96孔板中加入检测抗体，每孔100μl。室温孵育2 h。用洗涤缓冲液重复洗涤3次。每孔中加入100μl四甲基联苯胺(TMB)I溶液显色，室温孵育15 min，每孔加入100μl盐酸液(INHCL)终止反应，孔中的蓝色液体变成黄色。用酶标仪读取波长450 nm处光吸收值。读板在终止反应后30 min内进行。绘制标准曲线，计算样品GDNF含量。

1.2.4 分组 将动物随机分为模型组12只，单纯细胞移植组(ADSCs)12只，GDNF修饰细胞移植组(GDNF-ADSCs)12只，以正常大鼠为对照。将ADSCs组及GDNF-ADSCs组用0.25%胰酶消化细胞，用含10%FBS的DMEM培养基终止消化，吸管轻柔吹打数次，1 000 r/min离心10 min，弃掉上清，以无血清DMEM培养基再次重悬，200目滤网过滤，计数细胞，调整细胞浓度为5×106细胞/μl。移植靶点取纹状体内两点①前囟前(AP)1.8 mm，中线右(MR)2.4 mm，硬脑膜下(DV)4.7 mm;②AP 1.0 mm，MR 3.4 mm，DV 4.5 mm〔8〕。腹腔内注射 10%水合氯醛深度麻醉大鼠。固定大鼠到立体定向仪上注射，5μl/只(1μl/min)，注射后停针5 min，缓慢退针(1 mm/min)，缝合切口。术后实验动物正常饲养。

1.2.5 功能实验 分别于术后2、4、6、8 w进行旋转行为测试，大鼠的腹内注射阿扑吗啡0.5 mg/kg，注射10 min后开始观察，并记录大鼠的旋转行为共记录30 min。

1.2.6 免疫组化 模型组大鼠3只、ADSCs细胞组大鼠3只及GDNF-ADSCs组大鼠3只分别于移植后的2、4、6、8 w取纹状体和黑质部分脑片进行免疫组织化学染色显示TH表达。大鼠麻醉。颈总动脉灌注生理盐水40 ml，然后灌注4%多聚甲醛200 m l，断头取脑，固定于4%多聚甲醛中，脱水、包埋，常规石蜡切片，片厚5～6μm。脑组织切片脱蜡至水，3%H2O2，30 min，封闭内源性过氧化物酶，抗原修复，5%羊血清封闭，37℃，1 h，加入一抗，4℃，过夜，加入生物素化的二抗，37℃，30 min，二氨基联苯胺(DAB)避光显色，5 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3 统计学分析 使用Sigma Stat2.03软件。所有数据以±s表示，统计学处理采用单因素方差分析，q检验。

2 结果

2.1 ADSCs鉴定(流式细胞仪) 以CD44抗体标记ADSCs，经流式细胞仪检测CD44阳性细胞为84.28%。

2.2 ADSCs表达GDNF ELISA试剂盒检测显示在培养上清液中有分泌的GDNF，分泌量随培养时间的延长而增加(在培养的第 24、48、72、96小时)分泌量分别为(533.424±204.177)、(692.431 ± 162.044)、(1 367.893 ± 102.876)、(1 952.201±109.690)pg/m l。未行基因转染的ADSCs培养上清液未检测到GDNF的分泌。

2.3 GDNF修饰的ADSCs移植DA神经元存活的影响 DA神经元表达特异性细胞标志蛋白TH，采用免疫组化方法标记纹状体区域的DA神经元。术后2 w时，模型组大鼠DA神经元存活率较对照组明显减少，仅为对照组的30%;ADSCs组大鼠DA神经元存活率有所升高达到42%;GDNF-ADSCs组大鼠DA神经元存活率最高达50%。观察不同时间点各组大鼠DA神经元存活情况发现GDNF-ADSCs组DA神经元存活率最高，而且在第8周时观察到该组神经元存活率比前一时间点增高约10%。见图1。

图1 不同模型组对DN神经元存活率的影响

2.4 功能实验结果 阿扑吗啡诱导大鼠旋转实验显示单纯ADSCs组较模型组旋转次数下降，而ADSCs-GDNF组的旋转次数较ADSCs组下降，6 w以后尤其显著，各时间点有明显差异(P＜0.05)。见表1。

表1 PD大鼠移植后旋转行为学检测结果(±s，转数/m in)

表1 PD大鼠移植后旋转行为学检测结果(±s，转数/m in)

与ADSCs-GDNF组比较:1)P＜0.05

组别 移植前 移植后2 w 移植后4 w 移植后6 w 移植后8 w模型组 20.2±2.6 19.5±1.8 20.1±2.1 20.5±1.91)21.6±2.01)ADSCs组 20.2±2.6 18.3±1.5 17.2±1.3 13.2±1.41)10.2±1.71)ADSCs-GDNF组20.2±2.6 16.5±1.2 13.4±1.8 10.5±1.5 6.8±1.2

3 讨论

细胞移植是近年兴起的一种治疗PD的新兴技术，主要是针对DA神经元死亡进行的细胞替代治疗。胚胎干细胞首先被用于脑内移植，但由于伦理等原因，其使用受到限制。近来研究的热点集中到成体干细胞，尤其是对BMSCs的研究，但是从骨髓中获取BMSC会给病人带来一定痛苦，且骨髓总量有限，BMSCs在整个骨髓单核细胞总数中所占的比例低，且随着年龄增长逐渐下降，可获取的干细胞数量少。

ADSCs具有来源丰富、采集方便、体外扩增快和自体移植等特点，同骨髓基质组织同起源于中胚层的脂肪，因其内存在的干细胞与骨髓来源的干细胞具有很多相似性且可向神经细胞分化而更有利于神经移植研究〔4〕。在本实验发现ADSCs的表面标志表达为CD44与BMSCs具有相同的表达。在以往的实验研究中也验证了ADSCs具有向神经细胞、成骨等多方向分化的特性。这与文献报道是一致的。

GDNF是在PD治疗研究中最受关注的神经营养因子，也是在动物实验中对PD治疗有比较肯定疗效的神经营养剂和保护剂〔9〕。有研究证明GDNF能保护并促进纹状体和轴突中前突触DA能神经元的生存〔10〕。虽然GDNF是DA神经元发育和维持生长过程中的重要因子，对中脑DA神经元有保护和修复作用〔11〕。但由于其受体分布广泛，且不易通过血脑屏障等缺点，常规给药无法起作用，使其在临床的应用受到明显的限制。而干细胞所具有的生物学特性及优点，使其广泛应用于临床成为可能。有研究证明，胚胎干细胞、神经干细胞均能够诱导成DA能神经元〔12〕;也有大量报道，BMSCsw跨系分化成DA能神经元〔13〕。但也有研究报道干细胞诱导成DA能神经元的效率低，诱导后可供移植的细胞存活率低，以及在体内移植细胞存活时间短〔14〕。因此移植经修饰的干细胞，利用其良好的扩增能力，稳定表达目的基因产物，可以作为转基因载体结合有效的神经营养因子，可能对PD的治疗更加有益。

本实验取第三代培养的ADSCs，GDNF重组腺病毒转染ADSCs，并通过ELISA方法检测培养上清GDNF水平。发现GDNF的表达随培养时间的延长而增加。这与文献报道GDNF转染BMSCs的表达一致。这也再一次验证ADSCs与BMSCs具有相似的生物学物性。通过对模型组和ADSCs组的观察发现，ADSCs定居受损部位后受损部位的DA神经元存活率较模型组高，推测可能是由于其分泌一些细胞因子，对受损部位起到一定的保护作用。观察到GDNF-ADSCs组DA神经元的存活率最高，且随时间的延长DA神经元的存活数目增加，在第8周时较上1 w存活数目增加10%。这有可能是ADSCs转染GDNF后能够稳定的表达，且随时间的延长而增加使得DA神经元得到GDNF的营养、支持和保护作用，同时也可能使一些具有分化潜能的前体细胞在GDNF和ADSCs分泌的细胞因子的共同作用下诱导DA能表型出现，分化成新的DA神经元。通过动物模型观察到ADSCs-GDNF组阿扑吗啡诱导大鼠旋转实验的旋转次数最少，这可能是跟ADSCs稳定表达GDNF，对DA神经元起到保护作用有关。

1 Miyake T，Inaba M，Fukui J，et al.Prevention of graft-versus-host disease by intra-bonemarrow injection of donor T cells:involvementof bonemarrow stromal cells〔J〕.Clin Exp Immunol，2008;152(1):153-62.

2 Lee K，Majumdar MK，Buyaner D，et al.Human mesenchymal stem cells maintain transgene expression during expansion and differentiation〔J〕.Mol Ther，2001;3(6):857-66.

3 项 鹏，陈振光.丹参注射液诱导间质干细胞分化为神经元样细胞〔J〕.中山医科大学学报，2001;22(5):321-4.

4 Zuk PA，Zhu M，Ashjiana P，et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells〔J〕.Mol Biol Cell，2002;13(12):4279-95.

5 Gash DM，Gerhardt GA，Hoffer BJ.Effects of glial cell line-derived neurotrophic factor on the nigrostriatal dopamine system in rodents and nonhuman primates〔J〕.Adv.Pharmacol，1998;42:911-5.

6 Lin LF，Doherty DH，Lile JD，etal.GDNF:a glial cell line-derived neurotrophic factor formidbrain dopaminergic neurons〔J〕.Science，1993;260(5111):1130-2.

7 Schatz DS，Kaufmann WA，Saria A，et al.Dopamine neurons in a simple GDNF-treated meso-striatal organotypic co-culturemodel〔J〕.Exp Brain Res，1999;127(3):270-8.

8 牛朝诗，李 健，傅先明.脑内移植骨髓间质干细胞治疗帕金森病模型大鼠的实验研究〔J〕.立体定向和功能性神经外科杂志，2009;22(1):1-5.

9 Sun M，Kong L，Wang X，etal.Comparison of the capbility ofGDNF，BDNF，or both，to protect nigrostriatal neurons in a ratmodel of Parkinsons disease〔J〕.Brain Res，2005;1052(2):119-29.

10 Gash DM，Zhang Z，Ovadia A，et al.Functional recovery in parkinsonian monkeys treated with GDNF〔J〕.Nature，1996;380(6571):252-5.

11 Slevin JT，Gethardt GA，Smith CD，et al.Improvement of bilateralmotor functions in patientswith Parkinson disease through the unilateral intraputaminal infusion of glial cell line-derived neurotrophie factor〔J〕.J Neurosurgery，2005;102(2):216-22.

12 Kim DS，Kim JY，Kang M，et al.Derivation of functional dopamine neurons from embryonic stem cells〔J〕.Cell Transplant，2007;16(2):11-23.

13 Fu YS，Cheng YC，Lin MY，et al.Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton's Jelly to dopaminergic neurons in vitro:potenitial therapeutic application for Parkinsonism〔J〕.Stem Cells，2006;24(1):115-24.

14 Snyder BJ，Olanow CW.Stem cell treatment for Parkinson's disease:an update for 2005〔J〕.Curr Opin Neurol，2005;18(4):376-85.

R246

A

1005-9202(2011)12-2269-03

吉林省科技发展基金资助项目(No.200505214)

鲁质成(1955-)，男，博士，教授，主任医师，硕士研究生导师，主要从事脑出血与脊髓方面研究。

周井铎(1982-)，男，在读硕士，主要从事脑出血与脊髓方面研究。

〔2010-02-09收稿 2010-11-19修回〕

(编辑 袁左鸣/徐 杰)